時(shí)間分辨熒光免疫分析法在乙型肝炎病毒表面抗原檢測(cè)中的應(yīng)用

王雄

(陵水黎族自治縣婦幼保健院檢驗(yàn)科，海南陵水572400)

時(shí)間分辨熒光免疫分析法在乙型肝炎病毒表面抗原檢測(cè)中的應(yīng)用

王雄

(陵水黎族自治縣婦幼保健院檢驗(yàn)科，海南陵水572400)

目的探討時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)定量檢測(cè)乙型肝炎表面抗原(HBsAg)的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法分別用TRFIA和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)237例血清樣本HBsAg，并在高、中、低三濃度中各取20例標(biāo)本用兩種方法復(fù)檢，對(duì)比結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果在237例標(biāo)本中，TRFIA測(cè)得陽(yáng)性99例，ELISA陽(yáng)性91例，陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；高、中濃度標(biāo)本各20例均為陽(yáng)性，檢出率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，而低濃度標(biāo)本中用TRFIA測(cè)得陽(yáng)性20例，ELISA只有12例陽(yáng)性，檢出率差異有統(tǒng)計(jì)意義(P＜0.01)。結(jié)論TRFIA較敏感，在低濃度HBsAg檢測(cè)中更具優(yōu)勢(shì)，提高了臨床檢測(cè)水平，具有較高的實(shí)用價(jià)值。

時(shí)間分辨熒光免疫分析法；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)；乙型肝炎表面抗原；定量檢測(cè)

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(HBV)感染所導(dǎo)致的一種在全球廣泛流行的傳染病，以HBV感染數(shù)和HBsAg攜帶率估算，全世界HBsAg攜帶者有3.5億人，其中亞、非、拉地區(qū)有2.8億，據(jù)中國(guó)流行病學(xué)調(diào)查，乙肝人群發(fā)生率較高，HBsAg攜帶率約為15%[1]，占全世界HBsAg攜帶者的1/3，而HBsAg的檢出是乙型肝炎的早期診斷之一，因此需要一種準(zhǔn)確、靈敏、簡(jiǎn)便的檢測(cè)方法。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，其檢測(cè)的方法越來(lái)越多，各具特點(diǎn)。國(guó)內(nèi)分為定性和定量檢測(cè)，抗原定性實(shí)驗(yàn)一般是用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)，該法使用雙抗體夾心法，具有易操作、重復(fù)性好、試劑穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)；定量分析則有各種化學(xué)發(fā)光法和放射免疫分析法，這些方法因儀器、試劑昂貴或使用放射性元素而無(wú)法普及應(yīng)用。最新發(fā)展起來(lái)的采用非放射免疫標(biāo)記技術(shù)的時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定分析法(TRFIA)，用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，同時(shí)利用時(shí)間和波長(zhǎng)兩種技術(shù)有效排除干擾，具有酶標(biāo)記、同位素標(biāo)記技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，且不受樣品的自然熒光干擾，靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、操作流程短、標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍寬、易于自動(dòng)化和應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)得到極大發(fā)展[2-3]。為了加強(qiáng)對(duì)乙型肝炎潛伏期的檢測(cè)，本文采用ELISA法與TRFIA法檢測(cè)237例標(biāo)本血清，探討其在檢測(cè)HBsAg中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源隨機(jī)抽取來(lái)自本院門診健康體檢和孕產(chǎn)婦的乙肝測(cè)定血液標(biāo)本237例，同時(shí)用TRFIA和ELISA分別作定量和定性測(cè)定，其中男性126例，女性111例，年齡10～70歲，平均(46.47±15.69)歲。

1.2 試劑ELISA法使用北京萬(wàn)泰生物技術(shù)有限公司提供的乙肝病毒表面抗原診斷試劑盒，TRFIA法使用中山達(dá)安基因股份有限公司提供的乙肝病毒表面抗原定量檢測(cè)試劑盒。

1.3 儀器中山達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的DR-M6601時(shí)間分辨熒光免疫分析儀，芬蘭進(jìn)口Thermo-MK3酶標(biāo)儀等。

1.4 方法將分離到的標(biāo)本血清分別用TRFIA法和ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。TRFIA法定量檢測(cè)乙型肝炎HBsAg的含量；ELISA法定性檢測(cè)HBsAg，結(jié)果判為陰性和陽(yáng)性。實(shí)驗(yàn)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，同時(shí)加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控進(jìn)行檢測(cè)。先用兩種方法檢測(cè)收集的標(biāo)本血清HBsAg陰陽(yáng)例數(shù)，當(dāng)ELISA法測(cè)得S/COS＞1，TRFIA法＞0.5 ng/ml時(shí)，HBsAg結(jié)果為陽(yáng)性；反之，結(jié)果為陰性。然后，將TRFIA法測(cè)得的HBsAg定量結(jié)果按＞225 ng/ml，5～225 ng/ml，＜5 ng/ml為標(biāo)準(zhǔn)分為高、中、低三個(gè)濃度，并各取20份再用兩種方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)用配對(duì)資料的χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法測(cè)定237例臨床血清標(biāo)本結(jié)果在237例標(biāo)本中，TRFIA法測(cè)得結(jié)果陽(yáng)性99例(42%)，ELISA法測(cè)得結(jié)果91例(38%)，兩種方法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性有91例，TRFIA法陽(yáng)性而ELISA法陰性的有8例，利用配對(duì)資料的χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意義(χ2=0.56，P＞0.05)，兩法檢測(cè)結(jié)果符合率為96.62%。

2.2 兩種方法檢測(cè)高、中、低三種濃度血清HBsAg結(jié)果的比較將上述HBsAg含量高濃度血清(TRFIA法檢測(cè)結(jié)果＞225 ng/mL)，HBsAg含量中等濃度血清(TRFIA法檢測(cè)結(jié)果在5～225 ng/ml之間)，HBsAg含量低濃度血清(TRFIA法檢測(cè)結(jié)果＜5 ng/ml)各取20例分別用兩種方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2?？梢园l(fā)現(xiàn)，HBsAg含量高濃度和中濃度的血清用兩種方法均可檢測(cè)出來(lái)，符合率為100%，高濃度和中濃度的兩種檢測(cè)方法間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。但在HBsAg含量低濃度的血清中，由于接近ELISA的最低檢出濃度，只有60%的陽(yáng)性檢出率，有8例血清標(biāo)本處于標(biāo)本對(duì)臨界值(S/CO)以下而漏檢。采用配對(duì)資料的χ2檢驗(yàn)，兩法的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10，P＜0.01)，見表1。

3 討論

表1 兩種方法檢測(cè)高、中、低三種濃度血清HBsAg結(jié)果的比較(n=60)

國(guó)內(nèi)目前定性檢測(cè)乙肝HBsAg最常用的方法是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)。ELISA屬于初篩實(shí)驗(yàn)方法，該法簡(jiǎn)單、方便、快速、成本低，敏感性可達(dá)0.7 ng/ml[4]，測(cè)定下限進(jìn)口試劑盒可達(dá)0.2 ng/ml，國(guó)產(chǎn)試劑盒為0.5～2 ng/ml[5]，使用定性方法檢測(cè)HBsAg僅能對(duì)結(jié)果進(jìn)行陰、陽(yáng)性的判斷，這已無(wú)法滿足臨床的要求。在本實(shí)驗(yàn)表1中兩種方法檢測(cè)的結(jié)果符合率為96.62%，說(shuō)明了兩種方法檢查結(jié)果具有很高的一致性，但仍有少部分結(jié)果不符，這可能是ELISA法在操作中的影響因素較多，比如溶血、紅細(xì)胞等外源性物質(zhì)，自身抗體、補(bǔ)體和易發(fā)生交叉反應(yīng)的內(nèi)源性物質(zhì)以及手工加樣、洗板等操作因素都易引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性；而抗體的包被質(zhì)量及反應(yīng)溫度、時(shí)間、鉤狀效應(yīng)等都易引起實(shí)驗(yàn)結(jié)果的假陰性，另外ELISA法不能用于定量檢測(cè)，這局限了ELISA的應(yīng)用。在本實(shí)驗(yàn)中，用兩種方法檢測(cè)標(biāo)本HBsAg濃度旨在探討比較ELISA和TRFIA檢測(cè)該指標(biāo)的敏感性，ELISA法檢測(cè)的20例高、中濃度標(biāo)本均無(wú)漏檢，但在低濃度血清標(biāo)本HBsAg＜5 ng/ml的檢測(cè)中，有8例假陰性，陽(yáng)性率僅為60%，說(shuō)明TRFIA的敏感性要高于ELISA，在實(shí)際工作使用TRFIA法可避免因外源性或內(nèi)源性因素引起的漏檢和錯(cuò)診。

時(shí)間分辨熒光免疫分析法(TRFIA)因使用鑭系元素作為標(biāo)記物，有效排除背景熒光的干擾，提高了TRFIA法的靈敏度。而且時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)屬全自動(dòng)檢測(cè)儀，能提供穩(wěn)定、均一、可靠的試驗(yàn)條件，避免由人為因素所引起的加樣誤差。與ELISA相比，用TRFIA定量測(cè)定乙肝病毒血清標(biāo)志物給了臨床一個(gè)量化指標(biāo)，能準(zhǔn)確及時(shí)敏感地反映患者體內(nèi)病毒標(biāo)志物的含量，使結(jié)果更加直觀。近年來(lái)應(yīng)用熒光定量PCR法檢測(cè)HBV DNA由于波動(dòng)頻率和幅度較大，單獨(dú)使用很難精確識(shí)別非活動(dòng)性HBV攜帶者，HBsAg定量與HBV DNA定量形成了信息互補(bǔ)，HBsAg定量可以作為病毒感染的標(biāo)志，而HBV DNA定量則可以作為病毒復(fù)制的指標(biāo)，兩種方法聯(lián)合應(yīng)用可以識(shí)別非活動(dòng)性HBV攜帶者。TRFIA對(duì)于HBsAg的檢測(cè)靈敏度0.05 ng/ml以下[6]，能對(duì)低水平存在的HBsAg進(jìn)行有效檢測(cè)。在慢性肝炎(CHB)中HBV感染的自然史一般可分為4個(gè)期，即免疫耐受期、免疫清除期、非活動(dòng)或低(非)復(fù)制期和HBeAg陰性肝炎期，其中在非活動(dòng)期時(shí)HBsAg水平最低，使用TRFIA方法對(duì)HBsAg定量檢測(cè)可以用于準(zhǔn)確判斷CHB所處的階段，具有重要的臨床意義。

綜上所述，TRFIA的敏感性要高于ELISA，在實(shí)際工作可避免引漏檢和錯(cuò)診。而且HBsAg定量不僅可以反應(yīng)慢性HBV感染史，便于觀察HBV感染動(dòng)態(tài)和檢測(cè)低水平的HBV感染指標(biāo)，尤其還可以對(duì)抗病毒治療應(yīng)答情況進(jìn)行預(yù)測(cè)。目前時(shí)間分辨免疫熒光分析儀只適用于成批檢測(cè)，不適于單份樣本操作，而且操作時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，仍有一定的缺陷，但是隨著檢驗(yàn)技術(shù)的不斷進(jìn)步，HBsAg定量檢測(cè)必將在臨床應(yīng)用中發(fā)揮越來(lái)越大的作用。

[1]秦望森.兩種檢測(cè)乙肝血清學(xué)標(biāo)志物方法的臨床對(duì)比[J].中國(guó)老年雜志,2011,31(7):226.

[2]Diamandis EP.Time-resolved fluorometry in nucleic acid hyBfidization and wtem Blotting techniques[J].Eleetrophoresis,1993,14(9): 866-875.

[3]潘麗,李玲艷,李胡煥,等.時(shí)間分辨與酶聯(lián)免疫檢測(cè)乙型肝炎表面抗體的結(jié)果分析[J].實(shí)用醫(yī)技雜志,2011,18(10):1064-1065.

[4]陳佑明,黃敬,劉京平.兩種方法檢測(cè)乙型肝炎病毒表面抗原的比較[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床,2009,6(7):495-496.

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Clinical application of time-resolved fluoroimmunoassay for detecting hepatitis B virus surface antigen.

WANG Xiong.Department of Clinical Laboratory,Lingshui County Maternal and Child Health Hospital,Lingshui 572400, Hainan,CHINA

ObjectiveTo investigate the clinical application of time-resolved fluoroimmunoassay(TRFIA) in quantitative measurement of hepatitis B virus surface antigen.MethodsQuantitative and qualitative analysis of 237 serum samples were detected by TRFIA and ELISA,respectively.Twenty samples of high,medium and low concentration of HBsAg were taken respectively for redetermination by the two methods.ResultsOf the 237 samples, 99 were positive for HBsAg with TRFIA assay,and 91 were positive for HBsAg with ELISA assay.There was no statistically significant difference between the two methods(P＞0.05).The 20 samples of high or medium concentration of HBsAg were all positive by both TRFIA and ELISA,with no statistically significant difference between two methods(P＞0.05).However,the detection rate with TRFIA assay was significantly higher than that with ELISA assay in the 20 samples of low concentration(P＜0.01).ConclusionTRFIA assay is more sensitive in quantitative detection of hepatitis B virus surface antigen.Moreover,TRFIA assay has more advantages than ELISA in detection of low concentration samples.We believe that TRFIAhas a higher application value.

Time-resolved fluorimmunoassay(TRFIA);Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA); HBsAg;Quantitative detection

R512.6+2

A

1003—6350（2013）18—2693—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2013.18.1121

2013-03-21)

王雄。E-mail：www3630@163.com