阿托伐他汀對(duì)阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能及Klotho 蛋白的影響

楊松 吳德紅 柯燕 蔡克濤 武謙

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)發(fā)病可能與一種名為Klotho 的衰老相關(guān)基因有關(guān)［1］。該基因主要在腦內(nèi)海馬組織表達(dá)，基因敲除的Klotho 小鼠過早出現(xiàn)和人類衰老、老化相關(guān)的多種行為和病理生理改變［2］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在小鼠海馬組織內(nèi)，Klotho蛋白可能通過與細(xì)胞膜表面的特定受體結(jié)合而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，該信號(hào)傳遞可以抑制胰島素胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)從而出現(xiàn)胰島素抵抗［3］。

近年來，阿托伐他汀對(duì)癡呆的防治作用正逐漸引起人們的關(guān)注［4］。國外研究證實(shí)，他汀類藥物不僅能預(yù)防癡呆，對(duì)罹患癡呆的病人，還可能延緩和改善癡呆的進(jìn)展和癥狀［5-6］。

本文通過觀察阿托伐他汀對(duì)癡呆模型小鼠學(xué)習(xí)、記憶功能及Klotho 蛋白的影響，初步探討阿托伐他汀改善癡呆的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性昆明種健康小鼠40 只，體質(zhì)量27 ～35 g，6 周齡，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)110425，隨機(jī)分為模型組、生理鹽水組、阿托伐他汀組和加蘭他敏組，每組10 只。

1.2 藥物、試劑及儀器 阿托伐他汀(北京嘉林藥業(yè)，110211429);加蘭他敏(西安楊森制藥有限公司，940929);Aβ1-40購自于美國sigma 公司;將Aβ1-40溶解在高壓滅菌生理鹽水內(nèi)，貯存液濃度10 g/L，過濾除菌，－20 ℃保存。臨用前37 ℃孵育4 d，使其變?yōu)榫奂癄畹腁β。Klotho 及胰島素的ELISA 試劑盒購自上海藍(lán)基生物有限公司，嚴(yán)格按照試劑說明書操作;其他相關(guān)儀器均由十堰市太和醫(yī)院生命研究所提供。

1.3 模型制備 動(dòng)物以10%水合氯醛250 mg/kg 腹腔注射麻醉后，以立體定位儀固定頭部，剪開頭皮，暴露頭骨，在前囟后、中線右側(cè)旁，用牙科鉆鉆開顱骨，微量注射器自腦表面垂直進(jìn)針，模型組、阿托伐他汀組和加蘭他敏組動(dòng)物于右側(cè)腦室內(nèi)緩慢注射10 mg/ml 的Aβ1-402 μl，生理鹽水組動(dòng)物相同部位注射同等容積生理鹽水，留針5 min 后慢慢退出。以慶大霉素9 mg/kg局部消毒，縫合皮膚。

1.4 動(dòng)物處理 阿托伐他汀組動(dòng)物給予阿托伐他汀5 mg/kg 灌胃，加蘭他敏組動(dòng)物給予加蘭他敏1.03 mg/kg 灌胃，生理鹽水組和模型組給予等量生理鹽水灌胃，每天1 次，進(jìn)行28 d。

1.5 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 根據(jù)Morris 實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作［7］，實(shí)驗(yàn)分為兩部分:(1)定位航行實(shí)驗(yàn):用于測量小鼠對(duì)水迷宮學(xué)習(xí)和記憶的獲取能力。第1 天讓小鼠自由游泳2 min;從第2 天起，每天分上、下午兩段，每段訓(xùn)練4 次。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇一個(gè)入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁放入水中，記錄小鼠尋找并爬上平臺(tái)時(shí)所需時(shí)間(潛伏期)，每次訓(xùn)練間隔為60 s。如果大鼠在120 s 內(nèi)未找到平臺(tái)，須將其引至平臺(tái)，這時(shí)潛伏期記為120 s。(2)空間搜索實(shí)驗(yàn):在第5 天最后一次訓(xùn)練后撤除水下平臺(tái)，在同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，測其在120 s 內(nèi)跨過原平臺(tái)相應(yīng)位置的次數(shù)。

1.6 Klotho 蛋白及胰島素的檢測 將各組小鼠置于冰盤上開顱取腦，棄去嗅球和小腦，稱取海馬組織，用預(yù)冷的生理鹽水制成10 g/L 勻漿，4 ℃下3000 r/min離心15 min，取上清液－20 ℃保存。采用酶聯(lián)免疫分析法測定海馬組織Klotho 蛋白及胰島素含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn) 與模型組小鼠相比，阿托伐他汀組、生理鹽水組和陽性對(duì)照組動(dòng)物的逃避潛伏期明顯縮短，而跨越平臺(tái)次數(shù)明顯增加，差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05);阿托伐他汀組與生理鹽水組、加蘭他敏組相比，其逃避潛伏期及跨越平臺(tái)次數(shù)無明顯差異。見表1。

表1 各組小鼠Morris 水迷宮學(xué)習(xí)及記憶成績比較(±s，n=10)

表1 各組小鼠Morris 水迷宮學(xué)習(xí)及記憶成績比較(±s，n=10)

注:與模型組比較，* P ＜0.05

組別逃避潛伏期(s) 跨越平臺(tái)次數(shù)(n)45.78 ±3.201.64 ±0.91生理鹽水組19.86 ±2.35*7.86 ±1.34*阿托伐他汀組24.44 ±3.05*5.38 ±1.36*加蘭他敏組21.39 ±2.78*5.51 ±0.85模型組*

2.2 海馬組織Klotho 蛋白及胰島素水平 生理鹽水組和阿托伐他汀組動(dòng)物Klotho 蛋白定量明顯高于模型組(P ＜0.05);與模型組比較，阿托伐他汀組胰島素水平明顯增加(P ＜0.05);模型組與生理鹽水組及加蘭他敏組的胰島素定量測定無明顯差異。見表2。

表2 阿托伐他汀對(duì)Klotho 蛋白及胰島素的影響(xˉ±s，pg/ml，n=10)

3 討論

加蘭他敏是從石蒜屬植物中分離出的可逆性乙酰膽堿酯酶抑制劑，用于治療輕度到中度阿爾茨海默型癡呆癥，可改善記憶障礙［8］。本研究以加蘭他敏處理作為陽性對(duì)照，以探討阿托伐他汀對(duì)AD 小鼠的影響。

他汀類藥物可能通過調(diào)節(jié)腦內(nèi)膽固醇代謝、抑制載脂蛋白E 表達(dá)、減少β 淀粉樣蛋白形成、降低卒中風(fēng)險(xiǎn)和增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)元功能等機(jī)制起到防治癡呆的作用［9］。近年來研究顯示，他汀可通過上調(diào)Klotho 基因的表達(dá)而部分糾正衰老相關(guān)的癥狀及體征［10-11］。本文結(jié)果提示阿托伐他汀可改善癡呆小鼠的學(xué)習(xí)及記憶功能，其機(jī)制可能與對(duì)Klotho 基因表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。

最新研究發(fā)現(xiàn)，Klotho 基因不但在腦脈絡(luò)膜大量表達(dá)，海馬內(nèi)也有很強(qiáng)的表達(dá)［3］;該基因過度表達(dá)的小鼠體內(nèi)血漿Klotho 蛋白濃度升高的同時(shí)，胰島素的水平也明顯升高，相反Klotho 基因缺陷的同時(shí)胰島素濃度也出現(xiàn)下降［1］。進(jìn)一步的研究認(rèn)為Klotho 蛋白通過與細(xì)胞膜表面尚未鑒定的特定受體結(jié)合而啟動(dòng)了細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，該信號(hào)傳遞可以抑制胰島素和胰島素樣生長因子-1(IGF-1)的胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，因此出現(xiàn)胰島素抗性;對(duì)Klotho 基因突變小鼠同時(shí)進(jìn)行胰島素/IGF-1 通路干涉處理后，這種小鼠的衰老癥狀明顯緩解［12-13］。我們的研究證實(shí)了Klotho 蛋白與胰島素的同向性改變，提示Klotho 蛋白通過這種胰島素信號(hào)傳導(dǎo)途徑引起的胰島素抗性可能是改善癡呆的重要方式。

其他相關(guān)的2 種機(jī)制可能為他汀上調(diào)Klotho 基因的表達(dá)，改善小鼠學(xué)習(xí)及記憶功能作另一注解。Narumiya 等［10］發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)的IMCD3 細(xì)胞中，阿托伐他汀通過抑制細(xì)胞通路RhoA 途徑上調(diào)Klotho 基因mRNA的表達(dá)，且這一表達(dá)有著非常顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系;這一結(jié)果也被國內(nèi)的研究所證實(shí)［11］。此外，氟伐他汀也被認(rèn)為有促進(jìn)Klotho 基因敲除雜合子小鼠血管新生的作用，其作用機(jī)制可能是通過VEGF-p-Akt-NO 路徑實(shí)現(xiàn)的［14］。

綜上所述，阿托伐他汀可改善AD 小鼠的學(xué)習(xí)及記憶功能，其機(jī)制可能與其對(duì)Klotho 基因表達(dá)的上調(diào)有關(guān)。

［1］ Kurosu H，Yamamoto M，Clark JD，et al. Suppression of aging in mice by the hormone Klotho［J］. Science，2005，309(5742):1829-1833.

［2］ Kuro M，Matsumura Y，Aizawa H，et al. Mutation of the mouse Klotho gene leads to a syndrome resembling ageing［J］. Nature，1997，390 (6655):45-51.

［3］ Nagai T，Yamada K，Kim HC，et al.Cognition impairment in the genetic model of aging klotho gene mutant mice:a role of oxidative stress［J］. Faseb J，2003，17(1):50-52.

［4］ Jick H，Zornberg GL，Jick SS，et al. Statins and the risk of dementia［J］. Lancet，2000，356(9242):1627-1631.

［5］ Sparks DL，Sabbagh MN，Connor DJ，et al. Atorvastatin for the treatment of mild to moderate Alzheimer disease:preliminary results［J］. Arch Neurol，2005，62(5):753-757.

［6］ Mielke MM，Zandi PP，Sjogren M，et al. High total cholesterol levels in late life associated with a reduced risk of dementia［J］. Neurology，2005，64(10):1689-1695.

［7］ 毛雪璇，皮榮標(biāo).Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)影響因素的研究進(jìn)展［J］.中國行為醫(yī)學(xué)科學(xué)，2008，17(9):853-855.

［8］ 馬廣恩.加蘭他敏治療老年性癡呆癥的研究概況［J］. 藥學(xué)進(jìn)展，1998，22(3):153-156.

［9］ Dasu N. Statins and the prevention of dementia［J］. CAMJ，2001，165(7):908-909.

［10］Narumiya H，Sasaki S，Kuwahara N，et al. HMG-CoA reductase inhibitors up-regulate anti-aging klotho mRNA via RhoA inactivation in IMCD3 cells［J］. Cardiovasc Res，2004，64(2):331-336.

［11］張?jiān)绿m，田文，張子新，等. 匹伐他汀對(duì)Klotho 基因敲除雜合子小鼠血管新生的促進(jìn)作用［J］. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2006，22(2):163-168.

［12］Bartke A.Long-lived Klotho mice:new insights into the roles of IGF-1 and insulin in aging［J］.Trends Endocrinol Metab，2006，17(2):33-35.

［13］Unger RH. Klotho-induced insulin resistance:a blessing in disguise?［J］. Nat Med，2006，12(1):56-57.

［14］蔣娟娟，劉佳，舒潔，等. 氟伐他汀及高糖對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞klotho 蛋白表達(dá)的影響［J］. 江蘇醫(yī)藥，2010，36(13):1558-1561.