鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性研究

（中國藥科大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇南京 210009）

藻藍(lán)蛋白（phycocyanin，PC）主要存在于藍(lán)藻（Cyanophyta）、紅藻（Rhodophyta）、隱藻（Cryptophyta）和少數(shù)甲藻（Pyrrophyta）中，是這些藻類進(jìn)行光合作用的捕光色素之一，在螺旋藻中的含量高達(dá)10%～20%[1]。藻藍(lán)蛋白既可以作為天然色素廣泛應(yīng)用于食品、化妝品、染料等工業(yè)，同時(shí)也具有強(qiáng)烈熒光可制成熒光試劑、熒光探針、熒光示蹤物質(zhì)等，用于臨床醫(yī)學(xué)診斷、免疫化學(xué)及生物工程等研究領(lǐng)域中。藻藍(lán)蛋白的藥理活性非常廣泛，具有抗癌、抗氧化、治療腦缺血損傷、提高機(jī)體免疫力等多種生物活性[2]。因此研究藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定性，尤其是市售藻粉提取的藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性有重要的生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。至2012年有關(guān)從藻粉中提取藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定性研究鮮見報(bào)道。在保健食品上應(yīng)用比較多的一般為鈍頂螺旋藻，本文比較全面地研究了鈍頂螺旋藻藻粉提取的藻藍(lán)蛋白，其溶液和干粉在不同條件下的穩(wěn)定性，旨在為其開發(fā)和應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻藻粉購自江蘇省丹合生物工程有限公司；DEAE-Sepharose FF、羥基磷灰石、硫酸銨、氯化鈉、磷酸鉀、硝酸鉀等均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV1100紫外可見分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)。

1.3 方法

1.3.1 藻藍(lán)蛋白的分離純化

按照文獻(xiàn)[3] 的方法進(jìn)行。藻粉懸浮于50 mmol/L磷酸鹽緩沖中，反復(fù)凍融，4℃離心（10 000 g×10 min），上清加入固體硫酸銨至50%飽和度，4℃靜置過夜，離心（10 000 g×10 min），收集沉淀，溶解于少量磷酸鹽緩沖液（10 mmol/L，pH7.0）中，并在此緩沖液中充分透析，透析液過濾，上樣于上述磷酸鹽緩沖液平衡的DEAE-Sepharose FF柱，用含0～1 mol/L NaCl梯度的磷酸鹽緩沖液進(jìn)行梯度洗脫，收集藍(lán)色洗脫液，收集的洗脫液透析后，上樣于上述同樣緩沖液平衡的羥基磷灰石柱，10 mmol/L～300 mmol/L梯度的磷酸鹽緩沖液（pH7.0）梯度洗脫，收集A620/A280大于4的藍(lán)色洗脫液，透析后濃縮或凍干即為藻藍(lán)蛋白。

1.3.2 藻藍(lán)蛋白溶液穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.2.1 溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)

藻藍(lán)蛋白水溶液分別在 4、10、20、30、40、50、60、70℃下避光放置6 h，每隔1 h測定A620。

1.3.2.2 pH穩(wěn)定性試驗(yàn)

藻藍(lán)蛋白分別溶于pH2.0～9.0的緩沖液中，4℃避光放置，每隔一天測定A620。

1.3.2.3 光照穩(wěn)定性試驗(yàn)

藻藍(lán)蛋白水溶液分別在 0、500、1 000、2 000、4 000 lx光強(qiáng)下，室溫放置72 h測定其A620。

1.3.2.4 NaCl穩(wěn)定性試驗(yàn)

藻藍(lán)蛋白分別溶于0.5 mol/L～2 mol/L的NaCl時(shí)的穩(wěn)定性溶液中，室溫避光放置72 h測定其A620。

1.3.2.5 反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)

藻藍(lán)蛋白水溶液在-18℃和室溫反復(fù)凍融10次，測定其A620。

1.3.3 藻藍(lán)蛋白干粉穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.3.3.1 藻藍(lán)蛋白干粉溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)

取適量藻藍(lán)蛋白干粉，平攤于稱量瓶中，封口，厚度小于5 mm，置于60℃恒溫干燥箱10 d，分別在0、5、10 d時(shí)取樣，測定其水溶液的A620。

1.3.3.2 藻藍(lán)蛋白干粉光照穩(wěn)定性試驗(yàn)

取適量藻藍(lán)蛋白干粉，平攤于稱量瓶中，封口，厚度小于5 mm，置于25℃，照度4 500 lx條件下10 d，分別在0、5、10 d時(shí)取樣，測定其水溶液的A620。

1.3.3.3 藻藍(lán)蛋白干粉濕度穩(wěn)定性試驗(yàn)

取適量藻藍(lán)蛋白干粉，平攤于稱量瓶中，封口，厚度小于 5 mm，置于 25℃，相對濕度為（92.5±5）%（飽和KNO3溶液）或（75±5）%（飽和NaCl溶液）條件下，放置10 d，分別在 0、5、10 d 時(shí)取樣，測定其水溶液的 A620。

2 結(jié)果與討論

2.1 藻藍(lán)蛋白在溶液中的穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.1.1 溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)

溫度對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響，見圖1。

注：*P＜0.05，**P＜0.01，與 0 h 相比。

從圖1可以看出，藻藍(lán)蛋白在40℃以下較穩(wěn)定，50℃時(shí)，A620下降了12.87%，60℃和70℃時(shí)，A620急劇下降。由此可見，藻藍(lán)蛋白不宜在40℃以上的條件下放置。

2.1.2 pH穩(wěn)定性試驗(yàn)

pH對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響，見圖2。

從圖2可以看出，72 h內(nèi)，藻藍(lán)蛋白在pH4～8之間較穩(wěn)定。過酸（pH 2～3）或過堿（pH 9）的條件下均不穩(wěn)定。

2.1.3 光照穩(wěn)定性試驗(yàn)

光照對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響，見圖3。

從圖3可以看出，藻藍(lán)蛋白在光照條件下不穩(wěn)定。500、1 000、2 000、4 000 lx下，光照 72 h 后，藻藍(lán)蛋白的特征吸收峰均明顯下降，下降值超過40.11%，黑暗時(shí)，72 h后，吸光值也明顯下降，下降23.47%。光照條件與黑暗條件下下降比例相比，說明光照會使藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定性明顯下降。由此可見，藻藍(lán)蛋白應(yīng)在弱光下或最好避光條件下加工及應(yīng)用。藻藍(lán)蛋白保存時(shí)，應(yīng)避光。

2.1.4 NaCl穩(wěn)定性試驗(yàn)

NaCl對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響，見圖4。

從圖4可以看出，藻藍(lán)蛋白水溶液放置72 h后，其吸光值下降明顯，而在0.5 mol/L～2 mol/L的NaCl溶液中72 h后吸光值下降較小?？梢娨欢舛鹊腘aCl對藻藍(lán)蛋白有保護(hù)作用，但0.5 mol/L與2 mol/L的NaCl對藻藍(lán)蛋白的保護(hù)作用差別不大。

2.1.5 反復(fù)凍融穩(wěn)定性試驗(yàn)

反復(fù)凍融對藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性的影響，見圖5。

從圖5可以看出，反復(fù)凍融使藻藍(lán)蛋白的穩(wěn)定性降低，隨凍融次數(shù)愈多，活性下降會更明顯。因此，和其它蛋白一樣，藻藍(lán)蛋白應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融。

2.2 藻藍(lán)蛋白干粉穩(wěn)定性試驗(yàn)

2.2.1 溫度穩(wěn)定性試驗(yàn)

溫度對藻藍(lán)蛋白干粉穩(wěn)定性的影響，見圖6（a）。從圖6（a）可以看出，藻藍(lán)蛋白干粉在60℃下放置10 d，其穩(wěn)定性略有下降，說明干粉比其水溶液要穩(wěn)定得多，但長期保存盡可能在較低的溫度下為好。

2.2.2 光照穩(wěn)定性試驗(yàn)

光照對藻藍(lán)蛋白干粉穩(wěn)定性的影響，見圖6（b）。從圖6（b）可以看出，藻藍(lán)蛋白干粉在4 500 lx光強(qiáng)下，隨著放置時(shí)間的延長，其穩(wěn)定性有下降的趨勢，但比其水溶液要穩(wěn)定得多，盡管如此，長期保存宜弱光或避光。

2.2.3 濕度穩(wěn)定性試驗(yàn)

濕度對藻藍(lán)蛋白干粉穩(wěn)定性的影響，見圖7。

從圖7（a）和7（b）可以看出，藻藍(lán)蛋白干粉在濕度為（92.5±5）%和（75±5）%的條件下放置 10 d，其水溶液吸光值幾乎不變；濕度為（92.5±5）%放置5 d，藻藍(lán)蛋白干粉增重顯著，超過5%，而濕度為（75±5）%的條件下放置10 d增重1.8%。由此可見，藻藍(lán)蛋白干粉，在濕度為（92.5±5）%的條件下易潮解。

3 結(jié)論

鈍頂螺旋藻藻藍(lán)蛋白溶液，在pH處于4～8時(shí)，溫度低于40℃時(shí)比較穩(wěn)定；光照72 h后，藻藍(lán)蛋白穩(wěn)定性均有所下降，0.5 mol/L～2 mol/L的NaCl對藻藍(lán)蛋白均有穩(wěn)定作用，而反復(fù)凍融降低藻藍(lán)蛋白活性。干粉狀態(tài)下的藻藍(lán)蛋白，在溫度60℃時(shí)，藻藍(lán)蛋白性質(zhì)有一定改變；在4 500 lx光強(qiáng)下，穩(wěn)定性明顯下降；在濕度為（92.5±5）%時(shí)增重顯著，在濕度為（75±5）%時(shí)增重不顯著。因此，長期保存藻藍(lán)蛋白以干粉為宜，在弱光、小于60℃并低濕度環(huán)境中保存。

[1] 郝瑋.螺旋藻藻藍(lán)蛋白生理活性的研究進(jìn)展[J] .醫(yī)學(xué)綜述，2006,12(2):111-113

[2] 趙艷景,胡虹,王穎.藻藍(lán)蛋白生理活性及作用機(jī)制研究進(jìn)展[J] .安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2011,39(11):6332－6333,6490

[3] 歐瑜,董劍,吳梧桐.鹽生隱桿藻藻膽蛋白的分離純化及特性研究[J] .藥物生物技術(shù),2004,11(1):37-41

[4] 國家食品藥品監(jiān)督管理局.中藥、天然藥物穩(wěn)定性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[OL] .北京：國家食品藥品監(jiān)督管理局,2006.http：//www.sda.gov.cn/WS01/CL0844/10637.html