甘蔗黃葉病毒實(shí)時熒光RT-PCR檢測體系研究

王洪星，龔 殿，張雨良，王健華，劉志昕

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所/農(nóng)業(yè)部熱帶作物生物技術(shù)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?71101）

甘蔗黃葉?。ㄔ缙诜Q甘蔗黃葉綜合癥）于20世紀(jì)80年代末首先報(bào)道在美國夏威夷發(fā)生，90年代初在巴西造成嚴(yán)重危害，目前幾乎已擴(kuò)散至世界各產(chǎn)蔗國。該病的癥狀常出現(xiàn)在植株生長的中后期，在干旱條件下癥狀表現(xiàn)早而明顯，造成感病品種嚴(yán)重減產(chǎn)[1-3]。其病原ScYLV屬于黃癥病毒科（Luteroviridae）馬鈴薯卷葉病毒屬（Polerovirus），病毒粒體球形，直徑22～24 nm，在寄主體內(nèi)含量很低，僅分布于韌皮部篩管伴胞細(xì)胞質(zhì)中。Lockhart[4]首先利用電子顯微鏡在感病植株葉片韌皮部伴胞細(xì)胞質(zhì)中觀察到多面體ScYLV粒體；隨后利用抗血清技術(shù)檢測該病毒；Schenck[5]利用組織印跡雜交免疫法（TBIA）檢測ScYLV；Comstock[6]采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附測定方法（DAS-ELISA）進(jìn)行病原檢測。王伯輝等[7]在廣西觀察到甘蔗黃葉病并對其病原進(jìn)行了初步的檢測，許東林等[8]報(bào)道了發(fā)生在廣東蔗區(qū)的ScYLV分子鑒定結(jié)果。與目前使用的生物學(xué)鑒定、血清學(xué)檢測和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)RT-PCR等ScYLV檢測技術(shù)相比，實(shí)時熒光PCR技術(shù)不但靈敏度高于傳統(tǒng)PCR，而且能對病原體的數(shù)量進(jìn)行精確定量。SYBR Green I染料法具有靈敏度高、信噪比高、適用范圍廣和低價(jià)等特點(diǎn)。在核酸的實(shí)時檢測方面有很多優(yōu)點(diǎn)，由于它與所有的雙鏈DNA相結(jié)合，不必因?yàn)槟０宀煌貏e定制，因此設(shè)計(jì)的程序通用性好，且價(jià)格相對較低，可提高ScYLV的檢測效果。我們進(jìn)行了ScYLV的實(shí)時熒光RT-PCR檢測技術(shù)研究，以期建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏和簡便的檢測ScYLV的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為經(jīng)檢測感染了甘蔗黃葉病毒和高粱花葉病毒的植株，甘蔗感病材料采自海南省紅毛鎮(zhèn)甘蔗種植基地。

主要試劑和儀器：Mx3005型熒光定量 PCR儀、TaKaRa公司SYBR Premix Ex Taq試劑盒、RT-PCR試劑盒PrimeScript TM One-Step Ver.2.0購自寶生物工程（大連）有限公司，Taq酶及其它生物試劑均購自北京全式金生物科技有限公司，其它藥品為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 總核酸的提取 從待檢測甘蔗植株上取幼嫩組織，以TRIzol法[9]提取RNA樣品。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成 選取在GenBank上 （登錄號AF369923.1、AF369924.1、AF369925.1、AF369926.1、AF369927.1、AF369928.1、AF369929.1、AF141385.1、AF141385.1）登錄的 9 個 ScYLV 分離物高度保守的衣殼蛋白基因序列中，運(yùn)用Primer Premier 5.0、Oligo6.0和DNAMAN進(jìn)行基因同源性分析和引物設(shè)計(jì)。引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成[10]。

1.2.3 RT-PCR 以所提取病樣的總RNA為模板，以oligodT為反轉(zhuǎn)錄引物，進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)體系為25μL，反應(yīng)成分包括ScYLV CDNA2μL、10 pm/μL 上游引物 s-pf 1μL、10pm/μL 下游引物 s-pr1μL，10mM dNTP2 μL、Taq 酶 0.2μL、無菌水18.8μL。 PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性 3 min，95℃變性30 s，53℃退火1 min，72℃延伸1 min，循環(huán)35次；最后72℃延伸10 min。取10μL PCR產(chǎn)物與lμL染料相混合，在室溫下進(jìn)行1.2%瓊脂糖恒壓凝膠電泳。PCR產(chǎn)物利用純化試劑盒進(jìn)行切膠純化。

表1 用于實(shí)時定量PCR擴(kuò)增的引物特征

1.2.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建、篩選、鑒定與稀釋 按照PMD19-T-Vector試劑盒的操作說明將PCR產(chǎn)物與PMD19-T載體進(jìn)行連接，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans-CD201感受態(tài)細(xì)胞。從已轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞中提取重組質(zhì)粒，操作按照Axygen公司的質(zhì)粒小量抽提試劑盒進(jìn)行，用菌液PCR法對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；將鑒定為陽性克隆的質(zhì)粒進(jìn)行測序分析。同時用紫外分光光度計(jì)測定其濃度為1.16 μg/μL，按照公式CN=M×N/L×D計(jì)算其拷貝數(shù)。CN為質(zhì)?？截悢?shù)，M為檢測到的核酸最小濃度，N為Avgadro's number（6.022×l023molecules/mol）；L為核酸長度（質(zhì)?？傞L+插入目的片段長度，單位為kb），D為從1kb核酸轉(zhuǎn)化到道爾頓轉(zhuǎn)化因子（dsDNA=6.6×l05）。經(jīng)計(jì)算，得質(zhì)粒的拷貝數(shù)為6.0×109拷貝/μL。加入滅菌水以10倍為梯度將重組質(zhì)粒依次稀釋，放入-20℃冰箱備用。

1.2.5 引物濃度的優(yōu)化和退火溫度的優(yōu)化 以200nM、400nM、600nM、800nM四個引物濃度梯度進(jìn)行篩選；然后以優(yōu)化的引物濃度，以6×109拷貝/μL到6×102拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板，選取56℃到62℃的10個不同退火溫度進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，每個梯度設(shè)置兩個重復(fù)，觀察不同梯度引物濃度、不同退火溫度對熒光信號的影響。同時在最優(yōu)的反應(yīng)體系和條件下反應(yīng)，獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 特異性測試與重復(fù)性測試 選取感染高粱花葉病毒植株樣品和健康植株樣品的總核酸與ScYLV總核酸，在相同體系和條件下進(jìn)行擴(kuò)增，觀察熒光信號的變化；同時通過批內(nèi)和批間重復(fù)性測試，驗(yàn)證檢測體系的穩(wěn)定性。批內(nèi)重復(fù)性測試是通過對不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定3次，批間重復(fù)性測試是連續(xù)3d對同一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，通過測得的標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)而計(jì)算CV值。

1.2.7 線性范圍測試 以100倍梯度稀釋的6×108拷貝/μL到6×101拷貝/μL的重組質(zhì)粒為模板，在上述優(yōu)化的體系進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，通過觀察熒光信號的變化和r2值的大小，確定該體系的線性范圍。

1.2.8 靈敏性測試的對比試驗(yàn) 分別對己知濃度的ScYLV標(biāo)準(zhǔn)品10倍梯度稀釋，以此為模板分別進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)和普通PCR反應(yīng)，驗(yàn)證所建立的檢測方法的靈敏性。

1.2.9 田間樣品檢測 利用已建立的方法對來自田間的13份疑似樣品進(jìn)行實(shí)時定量PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段擴(kuò)增

利用RT-PCR法擴(kuò)增獲得的ScYLV CP基因的插入用目的片段，特異性PCR產(chǎn)物片段長度與預(yù)計(jì)目的片段大小基本一致（圖1）。

圖1 RT-PCR法擴(kuò)增ScYLVCP基因的插入用目的片段

2.2 ScYLV目的基因重組質(zhì)粒PCR鑒定結(jié)果

鑒定結(jié)果如圖2：獲得目的片段與預(yù)期大小相符，經(jīng)測序、blast分析，所插入目的片段正確，大小為189bp，說明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 PCR檢測重組質(zhì)粒

2.3 最佳引物濃度篩選結(jié)果

通過觀察熒光信號的變化可看出各個不同的引物濃度對擴(kuò)增曲線的影響不是很大，但是當(dāng)引物濃度為600nM時，熒光擴(kuò)增曲線最平滑，熒光值最高，呈典型“S”型形狀，平行管測定其重復(fù)性較好，且其Ct值也比其他組要小，說明其擴(kuò)增效率及檢測靈敏度比其它組高，確定引物濃度為600nM時，反應(yīng)較穩(wěn)定，曲線平滑，只有單一的峰，無非特異性擴(kuò)增，為該體系的最佳引物濃度（見圖3）。

圖3 引物濃度為600nM時的融解曲線圖

2.4 退火溫度的優(yōu)化結(jié)果

通過觀察不同退火溫度下擴(kuò)增曲線，看出該反應(yīng)在62℃到52℃之間的溫度變化不敏感，熒光信號均有增加，但是在58℃時PCR擴(kuò)增效率最好，因此確定58℃為該體系的最佳退火溫度（圖4，圖5）。

圖4 58℃退火溫度下的擴(kuò)增曲線圖

圖5 58℃退火溫度下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.5 特異性測試結(jié)果

圖6顯示：該體系只針對ScYLV樣品進(jìn)行了擴(kuò)增，對測試的SrMV和健康甘蔗樣品都沒有熒光曲線的擴(kuò)增，表明引物特異性好。

2.6 線性范圍測試結(jié)果

通過對一系列100倍梯度稀釋的ScYLV標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒進(jìn)行實(shí)時定量PCR反應(yīng)，并觀察熒光信號的變化，可以看出當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為 6×108拷貝/μL 到 6×101拷貝/μL 時，標(biāo)準(zhǔn)曲線有良好的相關(guān)性，可以檢測的線性范圍為6×l01～6×108拷貝（圖7）。

圖6 體系特異性檢測結(jié)果

圖7 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性苑圍

圖8 實(shí)時定量PCR檢測不同濃度的ScYLV重組質(zhì)粒1～8：6×108，6×107，6×106，6×105，6×104，6×103，6×102，6×101拷貝/μL 9：負(fù)對照

圖9 普通PCR檢測不同濃度的ScYLV重組質(zhì)粒泳道 l～8：6×108，6×107，6×106，6×105，6×104，6×103，6×102，6×101拷貝/μL 9：負(fù)對照

2.7 靈敏性測試的對比試驗(yàn)

結(jié)果表明，實(shí)時定量PCR能夠檢測到6×100拷貝/μL重組質(zhì)粒，而常規(guī)PCR只能檢測到6×102拷貝/μL重組質(zhì)粒，實(shí)時定量PCR檢測的靈敏度比常規(guī)PCR提高了100倍（圖8、9）。

圖11 田間樣品檢測擴(kuò)增曲線

2.8 重復(fù)性測試結(jié)果

對濃度高低不同的標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測定3次和連續(xù)3d對同一標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測，通過計(jì)算獲得該體系的批內(nèi)CV值為1.6%，批間CV值為3.2%，小于5%，說明重復(fù)性較好（圖10）。

表2 田間ScYLV分離株的實(shí)時熒光RT-qPCR檢測結(jié)果

2.9 田間樣品測試

適用性檢測結(jié)果：由表2、圖11可以看出，對來自田間受ScYLV不同致病力（強(qiáng)、弱和中等）感染的株系，該體系均可以進(jìn)行穩(wěn)定擴(kuò)增和定量檢測，因而可以作為一種適宜的定量和定性檢測手段來研究甘蔗黃葉病毒。

3 結(jié)論與討論

本研究建立了利用SYBR Green I染料法檢測ScYLV的實(shí)時熒光RT-PCR體系。該體系相關(guān)性好 （r2=0.993），特異性強(qiáng)，線性范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好且具有操作簡便、快速等優(yōu)點(diǎn)。檢測結(jié)果真實(shí)可靠，可以定量檢測田間受ScYLV不同致病力（強(qiáng)、弱和中等）感染的株系，其Ct值的高低直接反應(yīng)了各株系中ScYLV含量的高低。同時靈敏度比常規(guī)RT-PCR高出100倍，這不僅減少了假陽性和假陰性問題的出現(xiàn)，更適于對那些亞感病或無癥狀感染植株的診斷。大大提高了該病毒的檢出率，克服了常規(guī)PCR因靈敏度不夠而導(dǎo)致樣品檢測出現(xiàn)假陰性的不足。

因此，本研究建立的實(shí)時熒光RT-PCR體系非常適合于檢測ScYLV這樣在寄主中含量較低的病毒，并且具有成本相對低廉、檢測速度快、無需PCR后處理等諸多優(yōu)點(diǎn)。J.Korimbocus等[11]應(yīng)用Taqman-MGB探針法檢測ScYLV，本文所建立方法與此相比，具有檢測成本低，檢測方便等特點(diǎn)，檢測時只需要在反應(yīng)體系中加入模板，檢測的特異性只取決于引物的特異性，適宜大規(guī)?？焖贆z測。該方法的建立為ScYLV的檢測、防治以及無病毒苗木的生產(chǎn)提供了強(qiáng)有力的技術(shù)支持，也可以應(yīng)用于ScYLV的YLS效果評價(jià)和深入研究中。

[1]Schenk S.Sugarcane yellow leaf syndrome:history and current concepts[A].In：Rao G P,Ford R E，Tosic M,et al，Sugarcane Pathology[C].Vol.Ⅱ.Enfield，USA，Science Publisher Inc,2001：23-25.

[2]Rassaby L,Girard J C,Lemaire D,Costet L,Irey M S，Kodja H,Lockhart B E L,Rott P.Spread of sugarcane yellow leaf virus in sugarcane plants and fields on the island of Reunion[J].Plant Pathology,2004,53（1）:117-125.

[3]Izaguirre-Mayoral M L，Carballo D，Alceste C,Romano M，Nass H A.Physiological performance of asymptomatic and yeiiow leaf syndrome-affected sugarcane in Venezuela[J].Journal of Phytopathology,2002,150:13-19.

[4]Lockkhart B E L,Irey M J，Comstock J C.Sugarcane baccitliform virus，sugarcane mild mosaic virus and sugarcane yellow leaf syndrome[A].In:Sugarcane Germp-lasm Conservation and Exchage B J,Croft C M,PigginE S,Wallis and D M Hogarth（eds）,ACIAR Procee-dings[C].1996,67:113-115.

[5]Schenck S,J S Hu.Uses of tissue blot immunoassay to determine the distribution of sugarcane yellow leaf virus in Hawaii[J].Sugarcane,1997,4:5-8.

[6]Comstock J C,Irey M S,Lockhart B E L,et a1.Incidence of yellow leaf syndrome in CP cultivars based on polymerase chain reaction and serological techniques[J].Sugarcane,1998,4:21-24.

[7]王伯輝，朱秋珍，莫磊興，等.甘蔗黃葉綜合癥的RT-PCR檢測初報(bào)[J].甘蔗，2003,10（4）:13-14.

[8]許東林，周國輝，任小平，等.廣東甘蔗引種基地甘蔗黃葉病毒分子鑒定[J].植物病理學(xué)報(bào)，2005，35（5）：466-468.

[9]王洪星，張雨良，羅志文，等.應(yīng)用多重RT-PCR檢測甘蔗黃葉病毒和高粱花葉病毒[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，38（10）：128-131.

[10]王洪星，張雨良，羅志文，等.ScYLV和SrMV的PCR引物優(yōu)化設(shè)計(jì)[J].中國糖料，2012（1）：16-20.

[11]J.Korimbocus,D.Coates,I.Barker,and N.Boonham.Improved detection of Sugarcane yellow leaf virus using a real-time fluorescent（TaqMan）RT-PCR assay[J].Journal of Virological Methods,2002,103:109-120.