一株產(chǎn)高溫纖維素酶曲霉菌的發(fā)酵條件及培養(yǎng)基優(yōu)化

楊 捷，嚴(yán) 芬，葉秀云，李仁寬，劉志堅(jiān)，呂文靜，林 娟

(1.福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350116;2.福州大學(xué)酶高效表達(dá)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350002)

植物纖維是地球上最豐富且廉價(jià)的可再生資源［1］.纖維素酶是能夠降解纖維素生成小分子糖的一組復(fù)合酶，具有安全性和高效性，在生物能源、食品、飼料、紡織、洗滌等很多領(lǐng)域有著重要而廣泛的應(yīng)用.纖維素酶復(fù)合酶系由三類不同催化反應(yīng)功能的酶組成:內(nèi)切葡聚糖苷酶(endo-1，4-β-D-glucanase，EC 3.2.1.4)，外切葡聚糖苷酶(exo-1，4-β -D-glucanase，EC 3.2.1.19)和 β -葡萄糖苷酶(β -1，4-glucosidase，EC 3.2.1.21).其中，內(nèi)切葡聚糖苷酶因可水解羧甲基纖維素(carboxymethylcellulose，CMC)又被稱為 CMC 酶(carboxymethyl cellulase，CMCase)［2-3］.

目前，研究較多的纖維素酶生產(chǎn)微生物有木霉、曲霉等，而里氏木霉(Trichoderma reesei)來(lái)源的纖維素酶是商業(yè)化最廣的產(chǎn)品.當(dāng)前，我國(guó)纖維素酶的生產(chǎn)及應(yīng)用雖處于快速前進(jìn)階段，但生產(chǎn)廠家少，規(guī)模小，遠(yuǎn)不能達(dá)到社會(huì)需求，且纖維素酶產(chǎn)品存在酶活低、成本高、對(duì)高溫及酸堿等極端環(huán)境耐受性不佳等問(wèn)題，限制了其應(yīng)用.因此，通過(guò)篩選、誘變、改造等手段得到能夠高效表達(dá)性質(zhì)優(yōu)良的纖維素酶的菌種成為研究熱點(diǎn)［3］.另外，通過(guò)培養(yǎng)基及工藝條件的優(yōu)化可直接、快速、顯著地提高菌種產(chǎn)酶能力和降低生產(chǎn)成本，對(duì)經(jīng)濟(jì)可行的微生物發(fā)酵過(guò)程不可或缺［4］.特別是利用富含木質(zhì)纖維素的稻草秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物為原料進(jìn)行生產(chǎn)，不僅可有效利用資源，還可有效緩解因焚燒等而產(chǎn)生的環(huán)境污染問(wèn)題［5］.

由于纖維素降解菌和其產(chǎn)生的纖維素酶在具體的使用過(guò)程中需耐受一定的高溫條件，而耐高溫纖維素酶可較好地解決酶在高溫下變性的問(wèn)題，而且相對(duì)于中溫酶，酶促反應(yīng)速度快，還可解決工業(yè)生產(chǎn)能耗大的問(wèn)題，因此，耐高溫纖維素酶降解菌株的選育顯得尤為重要.本課題組在前期工作中選育得到一株產(chǎn)高溫纖維素酶的曲霉菌株F4，其CMC酶的最適反應(yīng)溫度為70℃;在70℃下保溫4 h，仍能保持約90%的酶活力，具有很好的熱穩(wěn)定性.而且，F(xiàn)4菌株的CMC酶的最適反應(yīng)pH范圍為4.0～4.8，在pH 3.0～7.0之間穩(wěn)定性較好［6］.本研究進(jìn)一步對(duì)這株曲霉菌的產(chǎn)酶培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以進(jìn)一步提高其纖維素酶活力.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

曲霉菌株F4為課題組從稻草秸稈堆肥中篩選獲得.

1.1.2 培養(yǎng)基

纖維素培養(yǎng)基:(NH4)2SO42 g·L-1，KH2PO41 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，NaCl 1 g·L-1，CMC 15 g·L-1，pH 6.0，分裝100 mL/250 mL.固體培養(yǎng)基添加20 g瓊脂，121℃蒸汽滅菌20 min.所用化學(xué)試劑均為分析純.

PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200 g，去皮，切成塊煮沸30 min，然后用紗布過(guò)濾，加蔗糖20 g，溶化后補(bǔ)水至1 000 mL，自然pH.固體培養(yǎng)基加入瓊脂20 g.

1.2 CMC 酶活力的測(cè)定［7］

將發(fā)酵液7 000 r·min-1離心10 min，吸取上清液作為粗酶液.取0.5 mL粗酶稀釋液于具塞比色管中，加入1.5 mL 1%CMC(0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液，pH4.8)，于50℃水浴精確反應(yīng)30 min后取出，立即用沸水浴滅活，按DNS比色法測(cè)定還原糖含量.以滅活的酶液作為空白.在上述反應(yīng)條件下，酶液每分鐘水解底物生成1 μmol葡萄糖的能力定義為1個(gè)酶活力單位(U).每組數(shù)據(jù)均平行測(cè)定3次.

1.3 液體培養(yǎng)基的優(yōu)化

以纖維素培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，逐一對(duì)培養(yǎng)基中的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽、表面活性劑、pH進(jìn)行優(yōu)化研究.

碳源對(duì)產(chǎn)酶的影響:分別以30 g·L-1的CMC、濾紙以及粉碎過(guò)的蔗渣(30～120目)和稻草(30～120目)作為單一碳源，加入2 g·L-1(NH4)2SO4、10 g·L-1NaCl、10 g·L-1KH2PO4和 5 g·L-1MgSO4·7H2O，pH5.0～6.0，配制成產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基.按每瓶1.2×107個(gè)孢子接種量接種，于37℃，120 r·min-1搖床培養(yǎng)5 d后測(cè)定粗酶液中的CMC酶活力，確定最佳碳源.選擇最佳碳源后，分別以20、30、40、50、60 g·L-1的碳源量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定最佳碳源添加量.

氮源對(duì)產(chǎn)酶的影響:在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，測(cè)定2 g·L-1的尿素、(NH4)2SO4、NH4NO3、NaNO3對(duì)產(chǎn)酶的影響(pH5.0 ～6.0).選擇最佳氮源后，分別以10、1.5、2、2.5、3、3.5、4 g·L-1的氮源量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，確定最佳氮源添加量.

無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響:通過(guò)L9(34)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)產(chǎn)酶培養(yǎng)基中NaCl、KH2PO4、MgSO4和CaCl2四種無(wú)機(jī)鹽配比［8］(pH5.0 ～6.0)，正交試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表1.

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響:在碳源、氮源和無(wú)機(jī)鹽優(yōu)化的基礎(chǔ)上，分別將產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基的初始 pH 調(diào)至4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，確定培養(yǎng)基最佳初始 pH.

添加表面活性劑對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響:在培養(yǎng)基中分別添加0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%和0.30%的甘油或吐溫-80，研究對(duì)F4菌株產(chǎn)酶的影響.

1.4 發(fā)酵條件的優(yōu)化

接種量的優(yōu)化:挑取兩環(huán)經(jīng)PDA平板培養(yǎng)基活化的F4菌株，接種于裝有100 mL PDA液體培養(yǎng)基的250 mL的三角瓶中，于37℃、150 r·min-1的搖床上培養(yǎng)24 h，得到種子液.在裝有100 mL稻草養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，分別接入2、4、6、8和10 mL的種子液，37℃、150 r·min-1發(fā)酵6 d，研究接種量對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶的影響.

發(fā)酵溫度的優(yōu)化:比較F4菌株在30、37、40、45、50℃下的產(chǎn)酶能力，確定最適發(fā)酵溫度.

裝液量的優(yōu)化:于250 mL錐形瓶中分別裝入20、40、60、80和100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，考察不同的裝液量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響.

搖床轉(zhuǎn)速的優(yōu)化:在上述條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上，將菌液分別置于90、120、150、180及210 r·min-1五個(gè)轉(zhuǎn)速下發(fā)酵6 d，比較產(chǎn)酶效果.

菌株產(chǎn)酶曲線的測(cè)定:將菌株在上述確立的最優(yōu)條件下發(fā)酵，每24 h取樣一次，測(cè)定酶活，繪制產(chǎn)酶曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 F4菌株產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基的優(yōu)化

2.1.1 碳源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響

以纖維素培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，考察了5種碳源對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的誘導(dǎo)效果.以稻草作為唯一碳源時(shí)產(chǎn)酶量最高，CMC酶活力達(dá)到了2.90 U·mL-1;CMC、麩皮和蔗渣的效果其次，而濾紙的效果最差(圖1).稻草和蔗渣雖同屬于天然纖維素，二者在纖維素組成上相似［9］，但可能因?yàn)檎嵩€含有蔗糖、果糖及葡萄糖等易利用碳源，對(duì)纖維素酶的合成具有阻遏作用，因此菌株利用蔗渣產(chǎn)酶的效果不及稻草.另外，麩皮的成分較復(fù)雜，含有淀粉等其它碳源［10］，其利用優(yōu)先于纖維素，且分解產(chǎn)生的還原糖對(duì)于纖維素酶合成也起到阻遏作用.

圖1 不同碳源對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.1 Effect of carbon sources on cellulase production by strain F4

圖2 稻草添加量對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.2 Effect of rice straw additions on cellulase production by strain F4

在選擇稻草作為最佳碳源后，考察不同稻草添加量對(duì)纖維素酶合成的影響.由圖2可知，隨著稻草添加量的增加，F(xiàn)4菌株的產(chǎn)酶能力不斷增強(qiáng)，當(dāng)?shù)静萏砑恿繛?0 g·L-1時(shí)，CMC酶活力達(dá)到最高(3.19 U·mL-1);之后，隨著稻草添加量的繼續(xù)增加，產(chǎn)酶能力迅速下降.經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)静萏砑恿繛?0～40 g·L-1時(shí)，發(fā)酵液菌體呈絮狀，稻草呈現(xiàn)粉末狀;而當(dāng)?shù)静萏砑恿繛?0、60 g·L-1時(shí)，發(fā)酵液菌絲球很多，極為粘稠.因此，確定稻草添加量為40 g·L-1.

2.1.2 氮源種類對(duì)產(chǎn)酶的影響

有機(jī)氮源諸如蛋白胨、牛肉膏等雖然營(yíng)養(yǎng)豐富［11］，但成本較高，所以主要考察3種無(wú)機(jī)氮源和一種簡(jiǎn)單有機(jī)氮源對(duì)于菌株產(chǎn)酶的影響(圖3).在碳源優(yōu)化的基礎(chǔ)上，硫酸銨作為氮源時(shí)產(chǎn)酶量最高，CMC酶活達(dá)到3.20 U·mL-1，其次是硝酸銨和硝酸鈉，尿素效果最差.因此選取硫酸銨作為氮源.進(jìn)一步比較硫酸銨不同添加量對(duì)菌株產(chǎn)酶的影響(圖4).隨著硫酸銨濃度的增加，纖維素酶產(chǎn)量不斷增加.當(dāng)硫酸銨添加量為3.5 g·L-1時(shí)CMC酶活力達(dá)到最高，為3.35 U·mL-1.當(dāng)硫酸銨濃度為4 g·L-1時(shí)酶活力又迅速下降，這可能是因?yàn)榈戳看螅w生長(zhǎng)過(guò)于旺盛，不利于纖維素酶的合成.因此，選取硫酸銨的最適添加量為 3.5 g·L-1.

圖3 不同氮源對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on cellulase production by strain F4

圖4 硫酸銨添加量對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.4 Effect of(NH4)2SO4concentrations on cellulase production by strain F4

2.1.3 無(wú)機(jī)鹽對(duì)產(chǎn)酶的影響

由于稻草屬于天然纖維素，其成分中已含有微生物所需的許多微量元素，因此本實(shí)驗(yàn)只選取4種大量元素考察其對(duì)纖維素酶合成的影響.選取氯化鈉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣作為因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)L9(34)進(jìn)行無(wú)機(jī)鹽配比優(yōu)化試驗(yàn)(表1).

表1 無(wú)機(jī)鹽對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Tab.1 Effect of salts on cellulase production by strain F4

由極差R可知，影響纖維素酶合成的無(wú)機(jī)鹽主次順序?yàn)镈＞B＞A＞C，最優(yōu)組合為D1B3A3C2，即NaCl 2 g·L-1、KH2PO42 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1.氯化鈣對(duì)于纖維素酶的合成有抑制作用，所以培養(yǎng)基中不宜添加氯化鈣;磷酸二氫鉀和氯化鈉對(duì)于纖維素酶的合成具有促進(jìn)作用，而硫酸鎂對(duì)于纖維素酶合成的影響最小，但過(guò)高或過(guò)低都不利于纖維素酶的合成.

2.1.4 培養(yǎng)基初始pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

培養(yǎng)基初始pH值對(duì)F4菌株產(chǎn)酶的影響見(jiàn)圖5.在4.0～5.5范圍內(nèi)隨著pH值的升高，纖維素酶產(chǎn)量逐漸升高，當(dāng)pH達(dá)到5.5時(shí)CMC酶活最高(3.77 U·mL-1);初始pH超過(guò)6.0以后，纖維素酶合成逐漸下降.由此可知，該菌株適宜生長(zhǎng)的pH為酸性，而其纖維素酶系的最適pH和穩(wěn)定pH也在酸性范圍內(nèi)，因此選定培養(yǎng)基的初始pH為5.5.

2.1.5 表面活性劑對(duì)產(chǎn)酶的影響

表面活性劑可以改變細(xì)胞表面的疏水性和極性等，使細(xì)胞膜更具有通透性，提高菌體胞外酶的分泌和酶與底物的接觸，從而提高微生物產(chǎn)酶量［12］.本實(shí)驗(yàn)考察了甘油和吐溫-80對(duì)菌株發(fā)酵產(chǎn)酶的影響(表2).相比之下，甘油對(duì)F4菌株的產(chǎn)酶有較好的促進(jìn)作用.當(dāng)甘油的添加量為0.20%時(shí)，發(fā)酵液中CMC酶活較對(duì)照組提高了約20%;當(dāng)甘油的添加量高于0.20%或吐溫-80的添加量高于0.15%時(shí)，纖維素酶活力呈現(xiàn)下降趨勢(shì).因此，確定培養(yǎng)基中甘油的添加量為0.20%.

通過(guò)培養(yǎng)基的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，最終確定培養(yǎng)基配方為:稻草40 g·L-1，(NH4)2SO43.5 g·L-1，NaCl 2.0 g·L-1，KH2PO42.0 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，甘油 0.20%，pH 5.5.在此條件下 F4菌株的CMC酶活為4.07 U·mL-1，與優(yōu)化前在纖維素培養(yǎng)基中發(fā)酵得到的CMC酶活(0.23 U·mL-1)相比，提高了16.7倍.

表2 表面活性劑對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Tab.2 Effect of surfactants on cellulase production by strain F4

圖5 培養(yǎng)基初始pH對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.5 Effect of initial culture pH on cellulase production by strain F4

圖6 接種量對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.6 Effect of inoculation volume on cellulase production by strain F4

2.2 F4菌株發(fā)酵產(chǎn)酶條件的優(yōu)化

2.2.1 接種量對(duì)F4菌株產(chǎn)酶的影響

當(dāng)接種量為4%時(shí)，產(chǎn)生的CMC酶活力最高(圖6).接種量較大(10%)時(shí)，菌株生長(zhǎng)繁殖過(guò)快，反而影響了產(chǎn)酶代謝的進(jìn)行，因此確定接種量為4%.

2.2.2 溫度對(duì)F4菌株產(chǎn)酶的影響

為使菌體快速生長(zhǎng)，代謝產(chǎn)物順利合成，在30～50℃之間選取5個(gè)不同的溫度進(jìn)行F4菌株的產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)(圖7).在37和40℃進(jìn)行發(fā)酵都可得到較高的CMC酶活力，確定發(fā)酵溫度為37℃.

2.2.3 裝液量對(duì)F4菌株產(chǎn)酶的影響

圖8表明，80 mL/250 mL的裝液量最適合CMC酶的合成.隨著裝液量的增加，酶活力呈現(xiàn)下降的趨勢(shì).可能的原因是，隨著裝液量的增加，液體培養(yǎng)基中的溶解氧會(huì)逐漸降低，影響了菌體的生長(zhǎng)和CMC酶的合成.

圖7 溫度對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.7 Effect of temperature on cellulase production by strain F4

圖8 裝液量對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.8 Effect of medium volume on cellulase production by strain F4

2.2.4 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)F4菌株產(chǎn)酶的影響

由圖9可知，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速達(dá)到150 r·min-1時(shí)，CMC酶活力達(dá)到了較高水平;繼續(xù)增加轉(zhuǎn)速，酶活力變化不大;當(dāng)轉(zhuǎn)速低于150 r·min-1時(shí)，CMC酶活力明顯降低.F4菌株為好氧菌，轉(zhuǎn)速過(guò)低不利于菌體生長(zhǎng)，因而影響了菌株的產(chǎn)酶能力;當(dāng)溶氧已達(dá)到菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)酶所需要的量時(shí)，繼續(xù)增大轉(zhuǎn)速對(duì)菌株產(chǎn)酶能力的提高并不明顯，因此，確定轉(zhuǎn)速為150 r·min-1.

2.3 F4菌株產(chǎn)酶曲線的測(cè)定

在優(yōu)化后的培養(yǎng)基和工藝條件下進(jìn)行產(chǎn)酶實(shí)驗(yàn)，繪制產(chǎn)酶曲線(圖10).隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵液中的CMC酶活力逐漸增高并在第8 d達(dá)到最高(12.26 U·mL-1).與工藝條件優(yōu)化前相比(4.07 U·mL-1)，菌株產(chǎn)CMC酶的能力提高了201%.

圖9 搖床轉(zhuǎn)速對(duì)F4菌株產(chǎn)纖維素酶的影響Fig.9 Effect of shaking speed on cellulase production by strain F4

圖10 F4菌株的產(chǎn)纖維素酶曲線Fig.10 Effect of incubation time on cellulase production by strain F4

3 結(jié)論

通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的優(yōu)化，使得曲霉F4菌株產(chǎn)耐高溫CMC酶的能力得到了較大幅度的提高，比優(yōu)化前提高了201%;另外，利用稻草作為碳源，不僅有助于變廢為寶、減輕環(huán)境污染，還可降低生產(chǎn)成本，為纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用打下基礎(chǔ).優(yōu)化后稻草發(fā)酵培養(yǎng)基配方為:稻草粉40 g·L-1，(NH4)2SO43.5 g·L-1，NaCl 2.0 g·L-1，KH2PO42.0 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1，甘油 0.20%，pH5.5;產(chǎn)酶條件為:接種量4%，溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速150 r·min-1，裝液量80 mL/250 mL，發(fā)酵時(shí)間8 d.

［1］鄒儀明.植物纖維素化學(xué)［M］.2版.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1995:152-154.

［2］Kubicek C P，Messner R，Gruber F，et al.The Trichoderma cellulase regulatory puzzle:from the interior life of a secretary fungus［J］.Enzyme and Microbial Technology，1993，15(2):90-99.

［3］Zhang Y H Percival，Himmel M E，Mielenz J R.Outlook for cellulase improvement:screening and selection strategies［J］.Biotechnology Advances，2006，24(5):452-481.

［4］Lynd LR，Weimer P J，Zyl W H V，et al.Microbial cellulose utilization:fundamentals and biotechnology［J］.Microbiology and Molecular Biology Reviews，2002，66(3):506-577.

［5］Abdulla H M.Enhancement of rice straw composting by lignocellulolytic actinomycete strains［J］.International Journal of Agriculture＆ Biology，2007，9(1):106-109.

［6］劉志堅(jiān).產(chǎn)纖維素酶耐高溫菌株的選育研究［D］.福州:福州大學(xué)，2009.

［7］李日強(qiáng)，辛小蕓.天然秸稈纖維素分解菌的分離選育［J］.上海環(huán)境科學(xué)，2002，21:8-11.

［8］Liu Jian，Yang Ji-chu.Cellulase production by Trichoderma koningii AS3.4262 in solid-state fermentation using lignocellulosic waste from the vinegar industry［J］.Food Technology and Biotechnology，2007，45(4):420-425.

［9］張瀟，朱冬青，王丹，等.粗糙脈抱菌(Neurospora crassa)木聚糖酶的合成及性質(zhì)研究［J］.纖維素科學(xué)與技術(shù)，2002，10(4):20-26.

［10］Cummings J H，Hill M J，Jenkins D J，et al.Changes in fecal composition and colonic function due to cereal fiber［J］.American Journal of Clinical Nutrition，1976，29(12):1 468-1 473.

［11］肖冬光.微生物工程原理［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2004:70-80.

［12］Kosaric N.Biosurfactants:production，properties，applications［M］.New York:Marcel Dekker，1993.