用于目標序列染色體定位的鏡鯉BAC-FISH體系構(gòu)建

鄧海霞 趙紫霞 徐 鵬 李 艷 王 書 孫效文

(1.大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院, 大連 116023; 2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院生物技術(shù)研究中心, 北京 100141;3.中國科學(xué)院國家基因研究中心, 上海 200233)

熒光原位雜交(Fluorescencein situhybridization,FISH)是一種連接分子水平和細胞水平上遺傳學(xué)研究的技術(shù)手段, 將標記后的核酸探針與染色體上的靶序列互補配對進行雜交, 經(jīng)熒光顯微鏡顯示出目標序列在染色體上的位置。目前 FISH技術(shù)在多個物種, 尤其是人類和植物基因組研究中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用, 例如細胞遺傳圖譜的構(gòu)建[1—3], 雜種中親本染色體的鑒定[4,5], 物種進化及親緣關(guān)系的探討[6,7], 轉(zhuǎn)基因材料中外源基因的定位[8]等。FISH技術(shù)在水生動物中的應(yīng)用還很有限, 僅有斑馬魚等模式生物開展了較為系統(tǒng)的細胞遺傳學(xué)研究[9,10]。在其他水生生物中以端粒、核糖體DNA等重復(fù)序列的FISH 定位研究[11—14]為主, 但單拷貝基因常為長度在幾kb左右的小片段DNA, 雜交信號檢出率較低,技術(shù)難度較大。

1992年Shizuya,et al.[15]以大腸桿菌F因子為基礎(chǔ)構(gòu)建細菌人工染色體 (Bacterial artificial chromosome, BAC), 用于構(gòu)建大片段基因組文庫。采用BAC克隆作為探針進行染色體原位雜交, 能夠有效克服單拷貝雜交信號弱的難題[16], 已在斑馬魚[10]、櫛孔扇貝[17]等多個物種中獲得了成功應(yīng)用。2011年本課題組成功構(gòu)建鏡鯉 BAC文庫[18], 包含 92160 個克隆, 平均插入片段長度為 141 kb。在該文庫基礎(chǔ)上, 本研究嘗試構(gòu)建鏡鯉(Cyprinus carpiovar.specularis)BAC-FISH實驗體系, 用于特定基因組片段的染色體定位, 在鯉魚染色體鑒別、細胞遺傳學(xué)圖譜構(gòu)建和鯉科魚類比較基因組研究中具有廣泛的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用魚采自中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所松浦實驗基地, 包括一齡鏡鯉 5尾, 體長14.7—19.2 cm, 體重 42—106 g。

1.2 有絲分裂中期染色體制備

實驗魚在25oC恒溫水族箱內(nèi)暫養(yǎng)48h以上后,腹腔注射植物血凝素(上海世澤生物科技有限公司),劑量為 60 μg/g魚體重。18h后腹腔注射秋水仙素(Sigma-Aldrich), 劑量為 6 μg/g魚體重。2h后剪尾鰭放血, 取體腎組織, 空氣干燥法制備有絲分裂中期染色體, 保存于?80℃冰箱。

1.3 包含目標序列的BAC克隆篩選

使用PCR法在本課題組已構(gòu)建的BAC文庫篩選池[20]中篩選包含目標序列的BAC克隆, 目標序列包括斑馬魚微衛(wèi)星標記Z6884 (GenBank： G41132.1)、Z4268 (GenBank： G41493.1)以及黃河鯉雄性特異性RAPD標記 CCmf1 (GenBank： FJ151368.1)。使用GenBank序列信息中所提供的引物。

根據(jù)篩選池篩選結(jié)果, 從原始BAC文庫中挑取包含目標序列的克隆, 涂布 LB平板挑取單克隆并PCR驗證, 避免保存過程中的菌株污染影響 FISH定位結(jié)果。

1.4 BAC質(zhì)粒探針制備

目標BAC克隆接種于2×YT液體培養(yǎng)基, 37℃培養(yǎng)過夜。堿裂解法提取質(zhì)粒,BamHⅠ(NEB)和EcoRⅠ(NEB)雙酶切處理20min, 乙醇沉淀純化。使用Nick Translation Kit (Roche)試劑盒對質(zhì)粒DNA進行生物素或地高辛缺刻平移標記, 標記試劑分別使用 Biotin-11-dUTP (MBI)和 Digoxin-16-dUTP (Roche)。標記后加入DNA封閉劑大腸桿菌tRNA (Roche)和鮭精DNA (Sigma-Aldrich), 再次進行乙醇沉淀純化,溶于去離子甲酰胺(上海生工)。

1.5 C0t-1DNA制備

酚氯仿抽提法制備鏡鯉基因組DNA, 配制成包含0.3 mol/L NaCl的工作液, 0.1 MPa高壓處理3min使 DNA片段大小下降到 100—1000 bp 范圍內(nèi)。DNA置 94℃變性 10min, 冰上 10S后轉(zhuǎn)移到65℃復(fù)性, 調(diào)整復(fù)性時間使C0t=1。本例中DNA濃度為210 ng/mL, 故65℃復(fù)性27min。復(fù)性結(jié)束后加入SⅠ核酸酶(MBI)消化尚未復(fù)性的單鏈 DNA, 用量為 1 U/μg DNA, 37℃保溫 10min, 加入 10 μL 0.5 mol/L EDTA, 70℃ 10min終止反應(yīng), 酚仿醇抽提純化, 溶于去離子甲酰胺。

1.6 染色體熒光原位雜交

染色體片65℃老化6h以上, 用0.5 mg/mL RNA酶 37℃處理30min, 卡諾氏固定液固定 5min, 置于含70%甲酰胺的4× SSC 中72℃變性2min, 迅速轉(zhuǎn)入?20℃梯度乙醇脫水。

將BAC探針和C0t-1DNA混合, 78℃變性10min,迅速置于冰上。配制雜交液, 組分為 5 ng/μL BAC質(zhì)粒探針, 50 ng/μL C0t-1DNA, 125 ng/μL 大腸桿菌tRNA, 125 ng/μL 鮭精 DNA, 2 μg/μL 小牛血清白蛋白(上海生工), 10%硫酸葡聚糖(Amresco), 50%去離子甲酰胺和4× SSC, 37℃預(yù)雜交30min。

每張染色體片滴加50 μL雜交液, 37℃雜交18h,雜交結(jié)束后用含50%甲酰胺的2× SSC溶液42℃洗滌 20min, 依次移入2× SSC、1× SSC和4× SSC洗滌。

1.7 熒光染色及信號放大

對于生物素標記的探針雜交片, 依次加入FITC標記的親和素(Sigma-Aldrich)、生物素標記的親和素抗體(Vector)、FITC標記的親和素進行反應(yīng); 對于地高辛標記的探針雜交片, 依次加入鼠抗地高辛抗體(Sigma-Aldrich)、TRITC標記的兔抗鼠抗體(Sigma-Aldrich)、TRITC標記的羊抗兔抗體(Sigma-Aldrich)進行反應(yīng), 使用各產(chǎn)品說明書推薦劑量。每次 37℃避光反應(yīng)1h, 反應(yīng)結(jié)束用含有1% Triton的4×SSC三次洗脫, 洗去未結(jié)合試劑。

1.8 雜交信號的熒光觀察

每張載玻片滴加50 μL含有5 ng/μL DAPI (或PI), 20 mg/mL DABCO, 100 mmol/L Tris(pH8.0),90 %甘油的熒光染色劑, 室溫3min后蓋片, 指甲油封片, 4℃染色 8h后使用 Imager.M2熒光顯微鏡(Zeiss)觀察。

2 結(jié)果

2.1 包含目標序列的BAC克隆篩選

在 BAC克隆池中篩選包含斑馬魚微衛(wèi)星標記Z6884的BAC克隆, 板池中P61位置、行池中R05位置和列池中 C07位置顯示擴增陽性, 表示陽性克隆位于第61板第5行第7列, 克隆號為CYC061E07。在原始文庫中挑取該克隆PCR驗證, 證實該克隆包含目標序列斑馬魚微衛(wèi)星標記Z6884。

用同樣方法篩選獲得包含斑馬魚微衛(wèi)星標記Z4268的BAC克隆CYC024C12, 含黃河鯉雄性特異性隨機擴增片段長度多態(tài)性(Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD)標記CCmf1的BAC克隆CYC010F24、CYC031A10、CYC036M11。值得注意的是CCmf1在篩選池中出現(xiàn)了不少于6個陽性信號, 本研究僅在信號最強的三塊板CYC010、CYC031和CYC036中進行了二次篩查獲得 3個克隆, 其實際克隆數(shù)應(yīng)更多。

2.2 微衛(wèi)星標記Z6884的FISH定位

使用地高辛標記鏡鯉BAC克隆探針CYC061E07,經(jīng)紅色熒光染料TRITC顯色和信號放大, 顯微鏡照片表明該克隆定位于鏡鯉一對近中著絲粒染色體長臂中部(圖1A)。

2.3 微衛(wèi)星標記Z4268的FISH定位

使用地高辛標記鏡鯉BAC克隆探針CYC024C12,經(jīng)紅色熒光染料TRITC顯色和信號放大, 顯微鏡照片表明該克隆定位于鏡鯉一對端著絲粒染色體著絲粒附近(圖1B)。

2.4 RAPD標記CCmf1的FISH定位

使用地高辛標記鏡鯉BAC克隆探針CYC010F24,經(jīng)紅色熒光染料TRITC顯色和信號放大; 使用生物素標記鏡鯉 BAC克隆探針 CYC031A10, 經(jīng)綠色熒光染料 FITC顯色和信號放大。顯微鏡照片表明CCmf1定位于鏡鯉的不少于四對同源染色體上, 且四對同源染色體之間形態(tài)和定位位置有明顯差異(圖 1 D、F)。

圖1C為地高辛標記 CYC010F24, 雜交液中不含C0t-1 DNA的染色結(jié)果照片, 染色體上存在大量未被封閉的雜交信號; 圖 1E為生物素標記CYC031A10, 親和素-FITC單次染色, 不經(jīng)信號放大的顯微鏡照片, 雜交信號不可見。

3 討論

3.1 BAC-FISH實驗條件優(yōu)化

在本研究中BAC-FISH實驗體系以冷泉港實驗操作手冊[19]中提供的方法為基礎(chǔ), 針對具體實驗對象和研究目的, 結(jié)合其他文獻方法, 對實驗條件做了以下探索和優(yōu)化調(diào)整。

圖1 鏡鯉 BAC 克隆 CYC061E07、CYC024C12(B)、CYC010F24(C、D)和CYC031A10 (E、F)的FISH定位Fig.1 FISH localization of mirror carp BAC clone CYC061E07(A, containing zebrafish microsatellite marker Z6884), CYC024C12 (B,containing zebrafish microsatellite marker Z4268), CYC010F24 (C,D, containing Yellow River carp male-specific RAPD marker CCmf1) and CYC031A10 (E, F, containing Yellow River carp male-specific RAPD marker CCmf1)

染色體片的前處理 按照原有方法, 染色體片固定后直接變性雜交, 視野中染色體之外的區(qū)域也出現(xiàn)了大量的染色信號, 可能由于制片材料頭腎細胞中RNA含量豐富, 對結(jié)果造成了干擾。參考文獻[1]中的方法使用 RNaseA 和蛋白酶預(yù)處理, 結(jié)果視野中染色體數(shù)量明顯減少, 染色體在蓋玻片邊緣聚集, 可能是因為蛋白酶破壞了染色體在玻片上的附著。最終確定僅用0.5 mg/mL RNAase A處理, 能夠明顯降低染色體區(qū)域外的雜信號干擾。在雜交染色和信號放大等一系列反應(yīng)和洗脫處理之后, 染色體形態(tài)往往變得模糊, 在染色體片前處理階段增加65℃老化處理步驟, 能夠有效維持染色體形態(tài)。

BAC質(zhì)粒探針制備 堿裂解法提取 BAC質(zhì)粒后直接進行缺刻平移標記制備探針, 雜交后信號檢出率較低; 本研究在標記探針前對BAC質(zhì)粒進行雙酶切處理, 信號檢出率有明顯提高。可能是因為雙酶切處理后質(zhì)粒 DNA被片段化, 尤其是原來處于閉環(huán)超螺旋狀態(tài)的質(zhì)粒被切斷, 同時探針長度變短,使標記效率和雜交效率都有所提高, 從而提高了信號檢出率。

C0t-1 DNA封閉基因組重復(fù)序列 C0t-1 DNA是富集了本物種重復(fù)序列的DNA混合制品。將基因組DNA物理打斷至100—1000 bp的范圍內(nèi), 94℃變性后控制復(fù)性時間使 C0t=1, 此時大部分重復(fù)序列復(fù)性為雙鏈, 非重復(fù)序列仍維持單鏈狀態(tài), 使用SⅠ核酸酶消化單鏈DNA, 則C0t-1 DNA主要成分為基因組中的重復(fù)序列[20]。在雜交液中加入10倍于BAC質(zhì)粒探針含量的C0t-1 DNA, 能夠封閉探針中可能存在的重復(fù)序列, 并與基因組 DNA 進行競爭性雜交, 使探針僅與染色體上實際對應(yīng)位點發(fā)生雜交反應(yīng)。使用BAC探針進行FISH定位的部分文獻中無需使用C0t-1 DNA封閉即可實現(xiàn)成功定位[21,22],也有文獻指出不使用C0t-1 DNA封閉會導(dǎo)致整個基因組均勻著色, 從而使雜交信號無法識別[17]。而在鏡鯉BAC探針CYC010F24 的定位過程中我們則發(fā)現(xiàn), 不使用 C0t-1 DNA封閉時, 染色體上會出現(xiàn)與雜交信號形態(tài)相似的著色點(圖1C)。如果雜交效率較低, 著色點數(shù)量不多, 或預(yù)期目標序列為重復(fù)序列時, 這些著色點非常容易與真正的雜交信號混淆,形成誤導(dǎo)性的假陽性結(jié)果, 因此C0t-1 DNA封閉對鏡鯉BAC-FISH實驗體系是不可或缺的步驟。

預(yù)雜交 本研究在變性的探針與染色體雜交之前, 增加了探針 37℃預(yù)雜交 30min的步驟, 目的是使探針中的重復(fù)序列先行復(fù)性為雙鏈, 避免與基因組DNA雜交。預(yù)雜交操作需要與C0t-1 DNA封閉配合進行, 當雜交液中不存在大量 C0t-1 DNA, 僅有探針、鮭精DNA和tRNA時, 預(yù)雜交操作并不能獲得明顯效果。

熒光染料的選擇 本研究使用了兩種雜交信號熒光染料, 分別為呈綠色熒光的 FITC和呈紅色熒光的 TRITC; 使用了兩種染色體熒光染料, 分別為呈藍色熒光的 DAPI和呈紅色熒光的 PI, 這些熒光染料各具優(yōu)缺點。在顯微鏡下FITC的信號較強, 無論在DAPI的藍色背景下, 還是在PI的紅色背景下都容易辨認, 但缺點是拍攝的照片雙色疊加后不易辨識, FITC的綠色與DAPI的藍色本身對比不強烈,當雜交信號較弱時容易被照片上藍色的染色體所掩蓋, 而FITC的綠色與PI的紅色疊加呈黃色, 在紅色的染色體照片上更不易分辨(圖1F)。紅色的TRITC與藍色的DAPI對比鮮明, 二者疊加后呈桃紅色, 在藍色染色體照片上也容易辨識, 缺點是信號較弱,猝滅也很快, 在顯微鏡下查找雜交信號較難。在后續(xù)研究中需要尋找更適合雜交信號染色和放大的紅色熒光染料。DAPI與PI的染色效果沒有明顯優(yōu)劣差別, DAPI的實用性更高, 因為它能夠與紅色和綠色的熒光染料共用, 從而實現(xiàn)兩種不同探針的雙色FISH共定位, 使用 PI對染色體著色后則無法再使用紅色熒光染料對雜交信號進行染色。

信號放大 不少 FISH實驗中用熒光染料直接標記探針, 或用熒光染料對標記探針進行單次染色,無需信號放大[3,23,24]。本研究在信號較強的FITC染色系統(tǒng)中嘗試單次染色, 但未觀察到熒光信號(圖1E)。這表明在現(xiàn)有鏡鯉BAC-FISH實驗體系中, 加入抗體進行信號放大仍然是必要的步驟。

通過條件優(yōu)化調(diào)整, 本研究構(gòu)建的 BAC-FISH實驗體系能夠成功實現(xiàn)已知基因組片段在鏡鯉染色體上的準確定位。定位對象既包括在染色體上有單一定位位點的序列, 如微衛(wèi)星標記Z6884和Z4268,也包括在染色體上有多個定位位點的序列, 如RAPD標記CCmf1。

3.2 斑馬魚微衛(wèi)星標記在鏡鯉染色體上的定位

大多數(shù)鯉科魚類的染色體數(shù)目為 50條(以斑馬魚為典型代表)或 48條(以草魚為典型代表)[25], 而鯉魚、鯽魚等部分物種染色體數(shù)目達到 100條, 即具有50對同源染色體。因此不少研究者推測, 鯉科魚類原始類群在進化過程中經(jīng)歷了一次染色體數(shù)目整體加倍事件, 在此基礎(chǔ)上進一步演化形成了鯉魚等現(xiàn)代物種[26]。

在這一假設(shè)之下, 每條斑馬魚染色體應(yīng)當與兩條鯉魚染色體相對應(yīng)。我們選取了位于斑馬魚17號染色體上的兩個微衛(wèi)星標記 Z6884和 Z4268, 在鏡鯉染色體上開展了 BAC-FISH定位, 結(jié)果顯示二者各自定位于一對同源染色體上, 兩對同源染色體之間有明顯形態(tài)差異。在已發(fā)表的鯉魚遺傳連鎖圖譜上[27], 這兩個微衛(wèi)星標記也位于不同的連鎖群(Linkage Group, LG), Z6884位于LG3, 而Z4268則位于LG20。

兩個斑馬魚微衛(wèi)星標記在鏡鯉染色體上的BAC-FISH定位結(jié)果為鯉魚染色體數(shù)目加倍的進化假設(shè)提供了一項直接實驗證據(jù), 同時也將現(xiàn)有的遺傳連鎖圖譜與具體的染色體對應(yīng)起來, 可作為染色體識別和細胞遺傳學(xué)圖譜構(gòu)建的依據(jù)。

3.3 黃河鯉性別相關(guān)標記在鏡鯉染色體上的定位

常重杰課題組 2009年報道了一個黃河鯉雄性特異性RAPD標記CCmf1, 并推測其為與性染色體進化早期階段相關(guān)的重復(fù)序列[28,29]。本研究在BAC文庫篩選過程中發(fā)現(xiàn)多個包含該片段的克隆, 進一步證實了該序列在基因組中拷貝數(shù)較多, 屬于重復(fù)序列。通過CYC010F24和CYC031A10兩個克隆的BAC-FISH定位, CCmf1標記被定位于不少于四對同源染色體上, 這些染色體的鑒別可能為性別決定基因篩查指引方向, 同時也可能為性染色體進化研究提供重要線索。

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