氮磷營養(yǎng)限制影響三角褐指藻光合無機碳利用和碳酸酐酶活性

李小梅 夏建榮

(廣州大學環(huán)境科學與工程學院, 廣州 510006)

海洋硅藻是海洋初級生產(chǎn)力的重要組成部分,其固碳量可以達到海洋初級生產(chǎn)力的 40%[1]。海洋硅藻也與高等植物一樣利用核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/氧化酶(Rubisco)固定 CO2。海洋藻類 Rubisco的Km(CO2)約為 40—60 μmol/L[2], 但實際海水中CO2濃度只有約 10 μmol/L(pH 8.0, 20℃), 因此海水中 CO2可能成為海洋硅藻光合固碳的限制因子, 但海洋硅藻的大部分種類均具有無機碳濃縮機制(CO2Concentrating Mechanism, CCM), 即通過 HCO3?的主動轉(zhuǎn)運和碳酸酐酶(Carbonic anhydrase) 調(diào)控HCO3?和 CO2的相互轉(zhuǎn)化, 在核酮糖-1, 5-二磷酸羧化酶/氧化酶周圍提高CO2濃度, 以維持較高的光合效率[3]。隨著大量污染物排入海洋, 海水中氮磷濃度出現(xiàn)了不同程度的升高[4], 使氮磷比明顯高于或低于Redfield比率(N∶P≈16), 導致浮游植物無法達到最適生長, 而處于營養(yǎng)(氮磷)限制狀態(tài)[5]。利用人工海水在實驗室探討海洋藻類生長與氮磷比關(guān)系, 結(jié)果顯示兩者具有明顯的相關(guān)性[6—8]。在近海自然海區(qū)浮游植物初級生產(chǎn)力與氮磷比關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)具有類似的結(jié)果[9]。氮磷比除了影響浮游植物的生長,還對其光合作用產(chǎn)生明顯的影響, 如氮限制可以導致細胞內(nèi)色素(特別是葉綠素)含量的減少、光系統(tǒng)I、II反應中心蛋白合成受阻而影響能量的轉(zhuǎn)換效率[10];氮限制也明顯降低 Rubisco活性與含量[11]。而磷限制可通過改變ATP/ADP的比例和降低Rubisco活性以影響卡爾文循環(huán)[12,13]。但氮磷限制對海洋浮游植物無機碳利用機制與碳酸酐酶活性影響還鮮有報道。本文利用海洋浮游硅藻三角褐指藻作為實驗材料, 在不同氮磷比人工海水中培養(yǎng), 探討三角褐指藻如何通過調(diào)控光合無機碳利用和碳酸酐酶活性以適應營養(yǎng)限制環(huán)境。

1 材料與方法

三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutumBohlin)購自中國科學院海洋研究所, 藻種用 f/2加富的人工海水進行培養(yǎng), 培養(yǎng)條件為： 光強200 μmol photons/(m2·s), 溫度 20℃, 光暗周期 12∶12, 通過濾空氣, 培養(yǎng)至對數(shù)期離心收獲, 用于不同氮磷比實驗。在人工海水配制過中加入不同量的無機氮磷, 分別達到表1設置的濃度與N∶P。

表1 氮磷營養(yǎng)限制實驗中的N、P濃度和N∶P設置Tab.1 N, P concentrations and N/P ratios under N or P-limited experiments

采用半連續(xù)培養(yǎng), 每天照光前將藻離心收獲,更換新鮮培養(yǎng)液, 細胞起始密度維持在(1.5—2.0)×106/mL, 培養(yǎng)條件同上, 培養(yǎng)5—6d后, 用于實驗。

1.1 生長測定

在培養(yǎng)第 5天, 分別在光照開始和光照12h后通過血球計數(shù)板對細胞進行計數(shù), 半連續(xù)培養(yǎng)生長速率按以下公式計算：

X2和X1分別為光照后和光照前細胞密度,t2和t1分別為當天光照結(jié)束與光照起始的時間。

1.2 葉綠素含量測定

在 4℃下用90%丙酮抽提 12h, 分別于 630 nm和664 nm處測其光密度值(OD值), 通過以下公式計算葉綠素含量[14]。

1.3 光合作用光響應曲線(P-I曲線)

取半連續(xù)培養(yǎng)5d后的藻, 重懸于新鮮的f/2加富的人工海水中, 取5 mL加入反應槽中, 用恒溫水浴槽控制溫度在 20℃, 光合放氧速率用生物氧測定儀(5300A, YSI)測定, 用鹵鎢燈照光, 通過調(diào)節(jié)鹵鎢燈與反應槽的距離獲得不同光強。用下列公式對P-I曲線進行非線性擬合[15]：

其中I為光照強度;P是光照強度I時所對應的光合速率;Pm為光飽和光合速率;α是光合作用在光限制部分的初始斜率, 表示光合效率;Rd為暗呼吸速率。

1.4 光合作用無機碳響應曲線(P-C曲線)

半連續(xù)培養(yǎng)5d后的藻懸浮于pH 8.2的25 mmol/L Tris緩沖液中, 取 4 mL加入反應槽, 在溫度 20℃,光強為 400 μmol photons/(m2·s)條件下, 用 YSI氧電極測定光合放氧速率。當反應槽中藻細胞光合放氧速率為0時(無機碳補償點), 注入NaHCO3溶液得到反應體系中的可溶性無機碳(DIC)濃度梯度, 得到光合放氧速率對DIC濃度的響應曲線(P-C曲線)。用下列公式對P-C曲線進行非線性擬合：

其中V為光合放氧速率,Vmax為最大光合放氧速率;[DIC]為反應介質(zhì)中總無機碳濃度;K0.5是當光合放氧速率達到最大光合速率一半時對應的無機碳濃度。

1.5 pH-drift 測定

將半連續(xù)培養(yǎng)的藻細胞收獲, 重新懸浮于新鮮的 f/2加富的人工海水中, 封閉, 在光強 200 μmol photons/(m2·s), 溫度 20℃下, 連續(xù)光照, 每隔一定時間測定培養(yǎng)液中的pH, 至穩(wěn)定為止。

1.6 質(zhì)膜氧化還原活性測定

通過測定完整藻細胞對 K3Fe(CN)6的還原作用確定質(zhì)膜的氧化還原活性[16]。測定時將細胞懸浮于新鮮培養(yǎng)液中, 加入K3Fe(CN)6, 使培養(yǎng)液中K3Fe(CN)6的初始反應濃度為0.50 mmol/L, 每隔30min取5 mL藻液離心, 取上清液測定其在420 nm處的吸光度。

1.7 碳酸酐酶活性測定

采用Willbur和Anderson方法測定胞內(nèi)、外碳酸酐酶活性[17]。離心收集藻細胞, 懸浮于8 mL pH 8.3巴比妥緩沖液中。在 4℃下迅速加入 4 mL 4℃CO2飽和水, 用 pH計監(jiān)測反應體系中 pH變化, 記錄pH從8.3降至7.3所需的時間。碳酸酐酶活性(U)的計算公式為：EU=10×(T0/T?1), 其中T0為反應體系中未加藻細胞時pH下降所需的時間,T為反應體系中加藻細胞時 pH下降所需的時間。胞外和總碳酸酐酶活性分別通過測定整個細胞和細胞經(jīng)超聲破碎后的碳酸酐酶活性獲得。碳酸酐酶活性單位(以單位細胞計)為EU/cell。胞內(nèi)碳酸酐酶活性=總碳酸酐酶活性?胞外碳酸酐酶活性。

1.8 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差表示。數(shù)據(jù)利用方差分析及多重比較進行分析, 并用星號“*”表示處理之間的差異顯著性水平(P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 不同N∶P對三角褐指藻生長的影響

不同N∶P下半連續(xù)培養(yǎng)5d后三角褐指藻的生長速率(圖1), 在N∶P=16∶1的人工海水培養(yǎng)下三角褐指藻的生長速率最大, 約為0.8/d, 其余4種氮磷比培養(yǎng)下生長速率均明顯下降(P<0.05), 表明高于或低于 N∶P=16∶1時, 三角褐指藻的生長明顯受到氮磷營養(yǎng)的限制, 其中嚴重的氮限制(N∶P=1∶1)使生長速率降低 75%, 嚴重的磷限制(N∶P=256∶1)則導致光照 12h后細胞數(shù)目比起始光照時明顯下降, 表明三角褐指藻的生長對嚴重磷限制比嚴重氮限制更敏感。

圖1 不同N∶P培養(yǎng)下三角褐指藻的生長速率Fig.1 Growth rate in P.tricornutum grown under the varied nutrient levels

2.2 不同N∶P對三角褐指藻葉綠素含量的影響

在不同氮磷水平培養(yǎng)下, 葉綠素a含量在(0.57—1.19)×10?7μg/cell 之間, 葉綠素c含量在(0.10—0.21)×10?7μg/cell(圖 2)。氮限制(N∶P = 4∶1 或 1∶1)導致葉綠素a含量分別下降 30.1% 和 47.6%(P<0.05), 磷限制(N∶P = 64∶1或 256∶1)下降39.1% 和52.4%(P<0.05), 但氮磷限制對葉綠素c含量沒有明顯影響(P>0.05)。

2.3 不同N∶P對三角褐指藻pH漂移曲線的影響

適應不同 N∶P下生長的細胞再在封閉系統(tǒng)中培養(yǎng), 培養(yǎng)過程中 pH變化(圖 3), 隨著培養(yǎng)時間的延長, pH逐漸升高, 營養(yǎng)充足條件下(N∶P =16∶1)培養(yǎng)的細胞pH達到穩(wěn)定時(即pH補償點)接近9.9。氮磷限制培養(yǎng)的細胞pH補償點明顯下降(P< 0.05)

圖2 不同氮磷比對三角褐指藻葉綠素含量的影響Fig.2 Effects of N∶P ratios on chlorophyll content in P.tricornutum

圖3 不同營養(yǎng)水平培養(yǎng)的三角褐指藻的pH漂移曲線Fig.3 pH-drift curves in P.tricornutum grown under the different nutrient levels

2.4 不同N∶P對三角褐指藻P-I曲線的影響

光合作用光反應曲線經(jīng)常用于測定藻類的光適應能力, 從圖4和表2可以看出不同營養(yǎng)水平培養(yǎng)對光飽和光合速率具有明顯的影響(P<0.05), 與營養(yǎng)充足培養(yǎng)相比, 在嚴重氮磷限制(N∶P=1∶1或256∶1)培養(yǎng)下光飽和光合速率分別下降39.7%和48.0%。光合效率(α)變化范圍在 4.0—7.3 μmol O2/(cell?h)×10?10/μmol photons/(m2?s), 氮磷營養(yǎng)限制培養(yǎng)下藻細胞α值明顯下降(P<0.05)。不同營養(yǎng)水平處理的細胞暗呼吸速率也明顯不同, 氮磷限制培養(yǎng)明顯低于營養(yǎng)充足培養(yǎng)(P<0.05)。

2.5 不同N∶P對三角褐指藻P-C曲線的影響

在光合作用與無機碳濃度響應曲線中(圖5、表3), 隨著反應液中無機碳濃度的升高, 光合速率均明顯增加, 但不同營養(yǎng)水平培養(yǎng)的細胞光合速率的變化存在一定差異, 氮磷限制導致最大光合速率下降28.7%和38.7%(P<0.05)。但達到最大光合速率一半時的CO2濃度在磷限制下下降了30%, 但氮限制并沒有明顯影響, 表明磷限制有助于提高細胞對CO2的親和力。

圖4 不同氮磷比培養(yǎng)的三角褐指藻的P-I曲線Fig.4 Photosynthesis-light response curves in P.tricornutumgrown under the medium with different N∶P

表2 不同營養(yǎng)水平培養(yǎng)下P-I曲線參數(shù)Tab.2 The parameters of P-I curves in P. tricornutum grown under the medium of different N∶P

圖5 不同氮磷比培養(yǎng)的三角褐指藻的P-C曲線Fig.5 P-C curves of P.tricornutum grown under the medium with different N∶P

2.6 不同N∶P對三角褐指藻質(zhì)膜氧化還原活性的影響

胞外碳酸酐酶活性經(jīng)常受到質(zhì)膜氧化還原活性的影響, 利用 K3Fe(CN)6的濃度變化可以測定質(zhì)膜氧化還原活性。圖6顯示不同營養(yǎng)水平培養(yǎng)的細胞具有明顯不同的 K3Fe(CN)6氧化還原速率, 營養(yǎng)充足培養(yǎng)細胞反應液中Fe(CN)63?下降速率更快, 表明在氮磷限制環(huán)境中生長的藻細胞質(zhì)膜氧化還原能力明顯低于營養(yǎng)充足條件下生長的細胞。

2.7 在不同N∶P培養(yǎng)下三角褐指藻碳酸酐酶活性的變化

不同營養(yǎng)水平培養(yǎng)對三角褐指藻碳酸酐酶活性的影響(圖7), 在不同營養(yǎng)水平培養(yǎng)下碳酸酐酶的活性明顯不同, 胞外碳酸酐酶的活性變化范圍在(0.76—1.52)×10?7EU/cell, 胞內(nèi)碳酸酐酶活性明顯低于胞外活性, 在(0.36—0.63)×10?7EU/cell。氮磷限制導致胞內(nèi)外碳酸酐酶活性明顯下降(P<0.05), 其中在氮限制下胞外碳酸酐酶活性分別下降 50%和37.5%, 在磷限制下下降22.3%和42.1%。嚴重的氮(N∶P=1∶1)或磷(N∶P=256∶1)限制導致胞內(nèi)碳酸酐酶活性下降36.5%和42.9%。

表3 不同N∶P培養(yǎng)下三角褐指藻P-C曲線的各參數(shù)Tab.3 The parameters of P-C in P.tricornutum grown under the different N∶P

圖6 不同氮磷比培養(yǎng)對質(zhì)膜氧化還原活性的影響Fig.6 The variation of plasma membrane redox activity in P.tricornutum grown under the medium with different N∶P

圖7 不同氮磷比培養(yǎng)對碳酸酐酶活性的影響Fig.7 Impacts of different N∶P on carbonic anhydrase activity in P.tricornutum

3 討論

3.1 氮磷限制對三角褐指藻生長與光合作用的影響

海洋浮游植物細胞內(nèi)氮磷元素的比例通常約為16∶1, 所以該比例常被用來作為判斷海洋浮游植物最適生長是否受到營養(yǎng)限制(氮磷限制)的指標[18]。但不同浮游植物對營養(yǎng)鹽的需求也存在一定差異,其最適生長所需的N∶P也存在一定的變化。Ho和Hodgkiss通過對香港海域赤潮藻類初級生產(chǎn)力的研究發(fā)現(xiàn), 它們最適生長所需的N∶P在4—16[19]。本研究結(jié)果顯示在N∶P=16∶1時生長速率明顯高于N∶P比大于 16∶1(N∶P=64∶1或 256∶1)或小于 16∶1(N∶P= 4∶1或 1∶1), 表明三角褐指藻在 N∶P=4∶1或1∶1的培養(yǎng)液中存在明顯的氮限制, 在N∶P=64∶1或256∶1培養(yǎng)液中存在明顯的磷限制。植物對氮磷限制的響應主要表現(xiàn)為： (1)促進營養(yǎng)鹽的吸收和同化; (2)減少生長與代謝速率以平衡細胞內(nèi)資源的有效利用[20,21]。在本研究中所使用的 N∶P比范圍內(nèi), 三角褐指藻細胞明顯采用第二種策略適應營養(yǎng)限制的環(huán)境, 表明在氮磷限制的環(huán)境中, 細胞已不足以恢復其最適生長, 但可以通過細胞生理活性的下調(diào)來維持適度的生長[20]。生長速率的降低也伴隨著葉綠素a含量的降低, 在營養(yǎng)限制環(huán)境中,原核與真核藻類色素含量的降低是一種常見現(xiàn)象,其原因可能在于氮是葉綠素a合成的原料, 氮限制可以導致葉綠素a的合成受限, 但氮磷限制對葉綠素c含量并沒有明顯影響, 表明氮磷限制并不影響藻細胞對光能的捕獲, 但對光能的吸收和利用能力降低, 營養(yǎng)物質(zhì)可能更多地流向其他代謝過程, 而對葉綠素a合成上的投入減少。

石巖峻等的研究表明不同氮磷水平對微小原甲藻光合特性具有明顯影響[22], Geider,et al.也發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)限制下光飽和光合速率存在明顯的下降[11]。三角褐指藻細胞在氮磷限制條件下光飽和光合速率變化與之相似。光飽和光合速率大小與無機碳的獲取、細胞內(nèi) Rubisco活性和含量密切相關(guān)[15]。在氮限制下生長的萊茵衣藻光合蛋白的合成速率明顯降低[23]。大型海藻(Gracilaria secundata)在氮限制培養(yǎng)下Rubisco含量下降了 50%[24]。有關(guān)維管束植物的研究表明飽和光合速率也受到 Rubisco 的底物核酮糖二磷酸再生速率的影響, 核酮糖二磷酸再生速率受到光合作用產(chǎn)物的反饋限制。磷酸鹽可以作為卡爾文循環(huán)和光合作用光反應的一種底物信號影響在Rubisco激活過程中Rubisco激活位點與非底物CO2的穩(wěn)定結(jié)合而增加這種反饋限制[13,25]。光合效率(α)與光捕獲效率和光合作用光能轉(zhuǎn)換效率密切相關(guān),在本研究中營養(yǎng)限制并沒有導致光能捕獲色素葉綠素c含量的變化, 表明在營養(yǎng)限制環(huán)境中, 光合效率的降低應與光合作用光能的轉(zhuǎn)換效率有關(guān), 這與營養(yǎng)限制條件下葉綠素a含量的下降是一致的, 同時光合效率的變化也與光飽和光合速率的變化是一致的。而在營養(yǎng)限制環(huán)境中藻細胞暗呼吸速率的降低可能與呼吸作用相關(guān)酶的合成減少和活性降低有關(guān)。

3.2 氮磷限制對三角褐指藻無機碳利用與碳酸酐酶的影響

pH 補償點常用來表示藻類利用 HCO3?的能力,pH補償點高于 9.2時被認為藻類具有直接利用HCO3?的能力[26], 本研究結(jié)果顯示在實驗所設置的營養(yǎng)水平范圍內(nèi)三角褐指藻 pH補償點均高于 9.2,但在營養(yǎng)限制條件下 pH的補償點下降, 表明三角褐指藻在營養(yǎng)限制條件下還能直接利用 HCO3?, 但HCO3?的利用能力與營養(yǎng)充足培養(yǎng)的相比有所下降,這可能與氮磷限制環(huán)境中 HCO3?的主動轉(zhuǎn)運所需能量(ATP)和載體蛋白合成減少有關(guān)。硝酸鹽還原與CO2固定需要消耗光合作用所產(chǎn)生的同化力, 碳氮的固定需要分享光合作用電子傳遞過程中產(chǎn)生的能量, 同時從無機氮合成氨基酸也需要細胞的碳骨架[27],因此氮代謝與光合無機碳利用過程是密切相關(guān)的。在微藻中 Rubisco和 CA合成所需的氮源需求的理論估計表明 CCM 活性的增加可能影響氮的利用效率[28]。氮限制導致小球藻(Chlorella emersonii)和鹽藻(Dunaliella tertiolecta)對無機碳的親和力明顯增加[28,29]; 但 Hu 和 Zhou的研究顯示, 在氮濃度達到300 μmol/L時對無機碳的親和力最大, 高于或低于這個濃度其對無機碳親和力均明顯下降[30]。我們的研究結(jié)果顯示在輕微的N限制(N∶P = 4∶1)下藻細胞對無機碳親和力并沒有明顯的影響, 表明氮濃度對藻類 CCM 的影響可能與藻的種類或與氮限制程度有關(guān)。小球藻(C.emersonii) 在磷限制環(huán)境中CCM 的活性受到部分抑制[31], 但在藻類C.vulgaris[32]和Nannochloropsissp.[30]中結(jié)果正好相反,我們的結(jié)果與后者相似。無機磷在細胞能量的傳遞過程中起著非常重要的作用, 由于無機碳的主動轉(zhuǎn)運過程需要ATP提供能量, 因此在磷限制環(huán)境中無機碳轉(zhuǎn)運可能受到抑制。同時, 在磷限制環(huán)境中細胞光合作用產(chǎn)生的大量糖類可以黏附在細胞表面,阻止 CO2擴散進入細胞內(nèi)[33], 從而可能導致細胞對無機碳的親和力明顯增加。

除了 HCO3?的直接轉(zhuǎn)運, 三角褐指藻還可以通過CO2的擴散和胞外CA催化海水中HCO3?轉(zhuǎn)化為CO2, 后者通過自由擴散進入細胞內(nèi), 以維持胞內(nèi)CO2的供應, 其中碳酸酐酶在調(diào)控細胞CCM機制方面具有重要作用。夏建榮等的研究表明在低氮磷濃度下小新月菱形藻胞內(nèi)外 CA活性明顯降低[34], 本研究結(jié)果顯示氮磷限制明顯抑制三角褐指藻胞內(nèi)外碳酸酐酶活性與之相似, 但 Kozlowska-Szerenos,et al.發(fā)現(xiàn)磷限制導致小球藻(C.vulgaris)胞內(nèi)外碳酸酐酶的活性均有所增加[35], 這可能與其碳酸酐酶的活性單位以單位葉綠素含量或細胞密度不同表示有關(guān), 在營養(yǎng)限制條件下葉綠素含量降低, 導致以單位葉綠素含量為單位的碳酸酐酶活性增加。Beardall,et al.的研究發(fā)現(xiàn)氮限制導致小球藻細胞具有較低CO2補償點和較高濃度的細胞內(nèi) CO2池, 同時減少氮在 Rubisco合成上的投入[36]。低氮磷濃度也明顯降低鹽藻Rubisco的合成量[11]。Majeau 和Coleman證實了Rubisco和CA基因表達存在一定的協(xié)同性[37],在光合固碳過程中 Rubisco和 CA維持一定的比例是非常重要的, 因此為了維持正常的光合效率, 在低氮磷環(huán)境中CA合成量也可能下降, CA的合成量減少也可使酶活性降低。另一方面, 胞外 CA活性的變化也受到質(zhì)膜氧化還原狀態(tài)的調(diào)節(jié), 我們的研究結(jié)果證實在氮磷營養(yǎng)充足的條件下, 細胞質(zhì)膜氧化還原的活性明顯高于氮磷營養(yǎng)限制培養(yǎng)的細胞,從而有利于啟動質(zhì)膜上的氧化還原鏈, 導致質(zhì)子逸出, 在胞外 CA活性位點周圍聚集, 從而激活胞外CA活性[38], 所以在營養(yǎng)充足培養(yǎng)下三角褐指藻細胞與營養(yǎng)限制培養(yǎng)相比具有較高的胞外CA活性。

4 結(jié)論

三角褐指藻在 N∶P=16∶1的培養(yǎng)液中生長速率最大, 氮磷限制導致三角褐指藻生長速率明顯下降并伴隨葉綠素a含量的下降, 但對葉綠素c含量并沒有明顯影響。氮磷限制明顯地降低光飽和光合速率、光合效率和暗呼吸速率。

三角褐指藻在氮磷限制環(huán)境中 pH補償點明顯下降, 磷限制有利于藻細胞提高對無機碳的親和力,但氮限制并沒有明顯影響。氮磷限制導致藻細胞質(zhì)膜氧化還原活性和胞內(nèi)外碳酸酐酶活性下降。三角褐指藻在氮磷限制的環(huán)境中通過調(diào)節(jié)葉綠素含量、無機碳利用方式和碳酸酐酶活性以維持適度的生長。

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