不同北蟲(chóng)草菌種的收集與分離

修翠娟，王艷華，孟 雙，陳 杰，吳英春

(1.遼寧省微生物科學(xué)研究院，遼寧朝陽(yáng) 122000;2.遼寧省科技創(chuàng)新體系建設(shè)服務(wù)中心，遼寧沈陽(yáng) 110004)

北蟲(chóng)草是一種名貴藥用真菌，(Cordyceps militaris(L.)Link)又稱蛹蟲(chóng)草，北冬蟲(chóng)夏草，是一種兼具食用和藥用價(jià)值的大型真菌。隸屬子囊菌門(mén)、肉座菌目、麥角菌科、蟲(chóng)草屬，是蟲(chóng)草屬的模式種，為蟲(chóng)生藥用真菌。近年的研究表明，北蟲(chóng)草除了富含蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素及鈣、錳、鋅、硒等微量元素外，還含有蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、過(guò)氧化物歧化酶(SOD)等生物活性物質(zhì)，具有增強(qiáng)動(dòng)物機(jī)體免疫力、抗腫瘤、抗輻射、降血糖、降血脂、抗疲勞、延緩衰老等多種生理功效［1-2］。因滋補(bǔ)、藥用功效與天然冬蟲(chóng)夏草相近，選為冬蟲(chóng)夏草的最佳替代品而進(jìn)行大量的人工培育，近些年來(lái)栽培范圍呈逐漸擴(kuò)大趨勢(shì)［3］。北蟲(chóng)草菌絲變異很快，種性退化要比一般的菌類快的多，優(yōu)良菌種的選育是提高北蟲(chóng)草子實(shí)體生物轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)品質(zhì)量的前提條件和關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 北蟲(chóng)草鮮體的收集 前后共收集到北蟲(chóng)草鮮體8個(gè)品株，具體生長(zhǎng)特征見(jiàn)表1、圖1。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸氫二鉀0.1 g，硫酸鎂0.1 g，瓊脂20 g，水1 000 mL。

1.2 方法

北蟲(chóng)草的菌株分離包括組織分離和孢子分離2種。由于孢子分離菌株得到的較多，后期菌株進(jìn)行比較的工作量較大，并且一些文獻(xiàn)表明，孢子分離得到的北蟲(chóng)草菌株性狀不穩(wěn)定，而且生物轉(zhuǎn)化率較組織分離低，子座組織分離得到的北蟲(chóng)草菌株，一般菌絲發(fā)育健壯、活力強(qiáng)，生物轉(zhuǎn)化率也較高［4］，本實(shí)驗(yàn)采用組織分離法。

表1 不同品種的北蟲(chóng)草生長(zhǎng)特征對(duì)比Table1 Characteristics of Different Cordyceps militaris

圖1 不同品種的北蟲(chóng)草生長(zhǎng)特征對(duì)比Fig.1 Characteristics of Different Cordyceps militaris

1.2.1 菌種組織分離 ①消毒:取新鮮、顏色鮮艷、生長(zhǎng)正常、形態(tài)健壯、顏色橙黃或橘紅色北蟲(chóng)草子座，先用清水沖洗，再置于75%的酒精或0.1%升汞中浸泡消毒2～3 min，取出子座以無(wú)菌水反復(fù)沖洗子座2～3次，放在無(wú)菌器皿內(nèi)備用;②組織分離培養(yǎng):用無(wú)菌剪刀將消毒的蛹蟲(chóng)草子座剪成長(zhǎng)度1～2 mm的小段，接種于PDA試管或平板固體培養(yǎng)基上，放置在22～25℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)48～72 h，菌絲開(kāi)始萌發(fā)，在組織塊周圍長(zhǎng)出放射狀的菌絲。北蟲(chóng)草菌絲白色，粗壯濃密，呈匍匐狀緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)。及時(shí)選擇無(wú)污染的菌絲體，接種于新的培養(yǎng)基上進(jìn)一步分離，最終得到純化的北蟲(chóng)草菌株。第一代菌株為母種，為F0級(jí)，依次傳代為F1級(jí)，F(xiàn)2級(jí)，F(xiàn)3級(jí)。

1.2.2 出草實(shí)驗(yàn) 為驗(yàn)證分離菌種是否為所需菌種，把分離得到的菌種回接到米飯或小麥培養(yǎng)基上進(jìn)行出草試驗(yàn)，接種后生長(zhǎng)速度快，不污染，生長(zhǎng)周期短，從子座形成到成熟不超過(guò)50～60 d，出草整齊，草型好，生物轉(zhuǎn)化率高的菌種可作為優(yōu)良的生產(chǎn)菌種。在蛹蟲(chóng)草的栽培過(guò)程中，不出草的原因大多是因?yàn)榫N質(zhì)量有問(wèn)題。所以優(yōu)質(zhì)的菌種是出草的前提，精細(xì)的管理是高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的保證。

2 結(jié)果與分析

菌株的鑒定:組織分離得到的北蟲(chóng)草菌株需要進(jìn)行菌株鑒定，以確定得到的菌株是否是北蟲(chóng)草菌株。菌株鑒定包括直接觀察法、鏡檢法、出草實(shí)驗(yàn)。

2.1 北蟲(chóng)草菌體在PDA固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況觀察

直觀法就是靠人的肉眼進(jìn)行直接觀察菌落形態(tài)，蛹蟲(chóng)草菌絲體初期為白色，粗壯，呈絨毛狀，略有爬壁。受光線刺激與基質(zhì)結(jié)合處呈現(xiàn)黃色。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，由黃色逐漸變成橘黃色。觀察不同的蛹蟲(chóng)草菌體在PDA培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況，結(jié)果見(jiàn)表2、圖2。

表2 不同北蟲(chóng)草菌絲體在PDA培養(yǎng)基5 d生長(zhǎng)情況Table2 Growth of different cordyceps militaris on PDA Culture after 5 day

圖2 不同北蟲(chóng)草菌絲體在PDA培養(yǎng)基5 d生長(zhǎng)情況Fig.2 Growth of different cordyceps militaris on PDA Culture after 5 day

一般來(lái)說(shuō)，蛹蟲(chóng)草菌絲體在第2～3天可觀察到，第4、5天左右生長(zhǎng)較好，菌落生長(zhǎng)旺盛。優(yōu)質(zhì)的蛹蟲(chóng)草菌株在培養(yǎng)初期菌絲為白色，粗壯濃密，邊緣整齊，匍匐狀緊貼培養(yǎng)基生長(zhǎng)，培養(yǎng)后期或者見(jiàn)光后，分泌黃色色素，菌落呈淺黃色到橘黃色。蛹蟲(chóng)草菌絲變異很快，種性退化要比一般的菌類快的多，如果只是單純的分離留菌種，就有可能大面積的減產(chǎn)。所以對(duì)北蟲(chóng)草菌種生長(zhǎng)特性的觀察與研究非常重要。

2.2 出草實(shí)驗(yàn)

除了對(duì)北蟲(chóng)草的菌落及顯微形態(tài)觀察外，還應(yīng)該進(jìn)行出草實(shí)驗(yàn)，出草實(shí)驗(yàn)是最直接的鑒定方法，對(duì)于分離得到的菌株，在用于生產(chǎn)之前都必須做出草實(shí)驗(yàn)，以了解其出草情況、質(zhì)量、生長(zhǎng)周期和生物學(xué)效率。在出草實(shí)驗(yàn)期間，主要觀察各個(gè)菌株萌發(fā)的時(shí)間、見(jiàn)光轉(zhuǎn)色的能力以及是否形成大量的氣生菌絲，以及出草時(shí)間是否正常，出草是否整齊等。有的蛹蟲(chóng)草菌株在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段受到微弱的光刺激就可以轉(zhuǎn)色，并進(jìn)入原基分化階段;而有的蛹蟲(chóng)草菌株即使長(zhǎng)滿培養(yǎng)基并給予充分的光刺激也不發(fā)生轉(zhuǎn)色效應(yīng)，這樣的菌株一般難以出草，必須及時(shí)淘汰。有的雖然出草，但很慢使得生產(chǎn)周期延長(zhǎng)，或者雖然出草但長(zhǎng)短不一，較稀疏，或者菌株變異草體異常變粗或變細(xì)，這樣的菌株都不能做為生產(chǎn)菌株。

3 討論

高產(chǎn)菌株的篩選直接關(guān)系到北蟲(chóng)草人工栽培的商業(yè)回報(bào)，優(yōu)良的北蟲(chóng)草子實(shí)體是獲得優(yōu)良人工栽培菌株的首要保證［6］。用于組織分離的蟲(chóng)草子座必須新鮮、生長(zhǎng)正常、形態(tài)健壯、顏色橙黃或橘紅色。子座分離的不同部位對(duì)子實(shí)體生長(zhǎng)的影響都非常大。

在進(jìn)行規(guī)模生產(chǎn)前，必須從獲得的北蟲(chóng)草菌株中選取性狀優(yōu)良的進(jìn)行出草實(shí)驗(yàn)，出草實(shí)驗(yàn)成功后才可進(jìn)行真正的規(guī)模生產(chǎn)。

北蟲(chóng)草高產(chǎn)菌株的篩選有許多關(guān)鍵因素，篩選出優(yōu)良菌株后，菌株的保藏條件、保藏時(shí)間，傳代復(fù)壯次數(shù)都對(duì)北蟲(chóng)草的生長(zhǎng)有至關(guān)重要的影響［7］。優(yōu)良的菌株傳2～3代后活力性狀下降，不能保證正常出草，必須再挑選優(yōu)良的北蟲(chóng)草子座再次進(jìn)行組織分離，重新篩選優(yōu)良高產(chǎn)栽培菌株，優(yōu)良菌株的收集與篩選是北蟲(chóng)草生產(chǎn)的重要基礎(chǔ)。

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