不同提取劑對粗細(xì)菌素提取效果的影響

許亦峰，羅曉蕾，施碧紅

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350108)

枯草芽胞桿菌在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生多種有抑菌活性的蛋白、多肽等代謝抗菌物，其中由核糖體合成的蛋白或多肽類抗菌物又稱細(xì)菌素［1］，不少由枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素已被用于醫(yī)藥、食品、化工、農(nóng)業(yè)生物防治、水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域［2］。對枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的粗細(xì)菌素進(jìn)行分離純化，獲得單一的有活性的抗菌物，是進(jìn)一步研究特定細(xì)菌素的結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的前提。純化的難點之一是對目標(biāo)物的濃縮，盡快除去雜質(zhì)。建立選擇性抽提和濃縮方法是關(guān)鍵。目前粗提細(xì)菌素常用的方法有硫酸銨沉淀法，酸沉淀法，有機溶劑抽提法等［3-4］。粗提方法的選擇要根據(jù)待純化的目的細(xì)菌素的性質(zhì)確定，粗提方法選擇的好壞直接影響細(xì)菌素的回收率和純化效率。本研究對枯草芽胞桿菌產(chǎn)生的細(xì)菌素粗提方法進(jìn)行比較分析，為后續(xù)的純化及結(jié)構(gòu)鑒定等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 試驗菌:Bacillus subtilisFB123，本實驗室分離鑒定并保存［5］;指示菌:大腸埃希菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)等，由本學(xué)院微生物實驗室提供。

1.1.2 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:牛肉膏0.3%，蛋白胨1.0%，NaCl 0.5%，pH 7.0～7.2。

1.2 方法

1.2.1 粗細(xì)菌素的制備 將枯草芽胞桿菌發(fā)酵液經(jīng)8 000 r/min，4℃，離心10 min，去菌體，獲發(fā)酵上清液。將發(fā)酵上清液等體積分成2份，分別按照硫酸銨沉淀和酸沉淀的方法進(jìn)行沉淀，離心獲得粗細(xì)菌素，用等體積的pH為6.5、0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解粗細(xì)菌素，收集粗細(xì)菌素。①硫酸銨沉淀法:在發(fā)酵上清液中緩慢加入等體積的飽和硫酸銨溶液，置4℃冰箱過夜沉淀。次日于9 000 r/min，4℃離心20 min，去上清，將沉淀用pH為6.5、0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解后置于－20℃冰箱保存?zhèn)溆?②酸沉淀法:用濃HCl溶液將發(fā)酵上清液的pH值調(diào)為2.0，4℃過夜沉淀，第2天于9 000 r/min，4℃離心20 min，傾去上清液，沉淀用 pH 為6.5、0.02 mol/L的磷酸鹽緩沖液溶解后置于－20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 各種有機溶劑抽提細(xì)菌素效果比較 將上述硫酸銨沉淀和酸沉淀得到的粗細(xì)菌素，分別取一定體積到EP管中，每管分別加入等體積的正丁醇，甲醇，三氯甲烷，甲醇和三氯甲烷的混合抽提液，10℃，180 r/min，振蕩2 h。振蕩結(jié)束后，9 000 r/min，4℃，離心15 min，傾去有機溶劑。將裝有抽提細(xì)菌素的EP管放入通風(fēng)櫥中干燥，同時設(shè)立等體積的有機溶劑做對照，用于排除粗提物中殘留的有機溶劑的影響。將細(xì)菌素抽提物，加入200 μL的磷酸鹽緩沖液，進(jìn)行梯度稀釋，以大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌作為指示菌，用玻璃平板法進(jìn)行抑菌試驗。用考馬斯亮藍(lán)法測定細(xì)菌素粗提物的蛋白濃度。

1.2.3 細(xì)菌素的活性測定-玻璃平板法 采用改進(jìn)后玻璃平板法［6］，將指示菌懸液加入到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中至終濃度約5×105cfu/mL，混勻、倒玻璃平板，凝固后用5 mm打孔器打孔。每個孔中分別加入20 μL不同濃度的樣品，以20 μL磷酸鹽緩沖液為對照，置30℃培養(yǎng)24 h，觀察、測定抑菌圈大小以及最低抑菌濃度，并估算其效價。其效價計算如下:效價(AU/mL)=1 mL/v×最大稀釋倍數(shù)。式中:v表示平板中每個孔的加量，單位是μL。

1.2.4 Bradford 測定蛋白濃度 考馬斯亮蘭法［7］(Bradford法)是1976年由Bradford根據(jù)蛋白質(zhì)與染料相結(jié)合能夠發(fā)生顏色反應(yīng)的原理設(shè)計的測定蛋白濃度的方法。配制系列不同濃度的牛血清蛋白(BSA)溶液，各加入適量考馬斯亮蘭G-250，分別測定其在595 nm下的吸光度，繪制蛋白質(zhì)濃度對吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定未知蛋白質(zhì)樣品的吸光度，每個樣品均設(shè)，3個平行樣，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算蛋白質(zhì)的濃度。

2 結(jié)果與分析

確定合適的粗提方法是提高細(xì)菌素得率的關(guān)鍵步驟，為此本研究比較了不同沉淀法對枯草芽胞桿菌發(fā)酵液中細(xì)菌素的粗提效果。

2.1 硫酸銨沉淀和酸沉淀所得粗產(chǎn)物的比較

兩種沉淀法獲得的粗產(chǎn)物外觀上差異較大(表1)，酸沉淀收集的粗產(chǎn)物呈黃色，較為粘稠;硫酸銨沉淀法獲得的粗產(chǎn)物僅淡黃色，較澄清。上清液中殘留的產(chǎn)物差異也很大，硫酸銨離心后的上清仍很渾濁，而酸沉淀的上清顯得較為澄清，說明酸沉淀法能夠更加有效地沉淀目標(biāo)產(chǎn)物，殘留在上清中的產(chǎn)物較少。以上結(jié)果初步表明酸沉淀法是濃縮沉淀細(xì)菌素的更為有效的方法。

表1 兩種沉淀法獲得的粗細(xì)菌素外觀的比較Table1 Comparison of the appearance of the crude bacteriocin obtained by two kinds of precipitation method

進(jìn)一步對粗產(chǎn)物的蛋白含量進(jìn)行分析。測定待測樣品在595 nm波長下的光吸收值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線(y=0.035 7x+0.038 8，R2=0.990 2)，計算待測樣品蛋白的含量。酸沉淀和硫酸銨沉淀法所獲粗產(chǎn)物中蛋白濃度如表2所示。

由表2可以看出利用酸沉淀法，比硫酸銨沉淀法沉淀粗蛋白的量提高了28.66%，酸沉淀的得率為49.04%，高于硫酸銨沉淀法的得率38.12%，是一種更加有效的沉淀細(xì)菌素的方法。

2.2 硫酸銨沉淀法和酸沉淀法粗產(chǎn)物活性的比較

活性是評價一種純化方法最重要的指標(biāo)。取等體積的硫酸銨沉淀物及酸沉淀物，測定其蛋白濃度、最大抑菌倍數(shù)，分別計算酸沉淀和硫酸銨沉淀所得沉淀物的效價，總活性等。結(jié)果如表3所示。

表2 兩種沉淀法所得粗細(xì)菌素中的蛋白含量Table2 The protein content of the crude bacteriocin obtained by two kinds of precipitation method

表3 兩種沉淀方法的細(xì)菌素活性比較Table3 Comparison on the activity of the bacteriocin obtained by two kinds of precipitation method

結(jié)果表明，酸沉淀所得粗產(chǎn)物的單位效價是硫酸銨沉淀法的2倍，且酸沉淀所得產(chǎn)物的比活性提高了55.46%。另外利用酸沉淀法還可以減少操作體積，簡化純化步驟，同時也避免了硫酸銨沉淀法所帶來的鹽離子濃度太高的影響，是一種針對細(xì)菌素較理想的沉淀方法。

2.3 不同有機溶劑抽提粗細(xì)菌素的效果比較

將硫酸銨沉淀和酸沉淀得到的粗細(xì)菌素，分別加入等體積的正丁醇，甲醇，三氯甲烷，甲醇和三氯甲烷的混合抽提液，振蕩抽提后，離心收集粗細(xì)菌素。用考馬斯亮藍(lán)法測定各有機溶劑抽提所得粗細(xì)菌素的蛋白濃度，計算得蛋白總量。結(jié)果如圖1所示。

由圖1看出，不論是對硫酸銨沉淀物或酸沉淀物，三氯甲烷和混合抽提液的抽提效果都顯著高于正丁醇或甲醇的抽提效果。特別是混合抽提液對酸沉淀物的抽提效果尤其顯著，蛋白總量達(dá)6.24 mg，是正丁醇抽提同樣沉淀物的5.2倍。這可能與混合抽提液含極性大小不一的有機溶劑，增加了對具有雙極性的粗細(xì)菌素的溶解度，從而更加有效地抽提粗細(xì)菌素［8］。

圖1 兩種沉淀物分別用不同有機溶劑抽提粗細(xì)菌素的效果比較Fig.1 Comparison of the extraction effect of the crude bacteriocin by treatment two kinds of sediments with different organic solvents

有機溶劑能夠有效地沉淀蛋白，但同時有機溶劑也會影響細(xì)菌素的活性，造成活性的損失。為此，研究觀察了不同有機溶劑抽提粗細(xì)菌素沉淀物的效果與活性，結(jié)果如表4所示。

表4 不同有機溶劑抽提粗細(xì)菌素的蛋白總量及活性測定Table4 The protein content and the activity of the crude bacteriocin extracted by different organic solvents

從表4可以看出，用不同有機溶劑抽提等體積細(xì)菌素沉淀物，所獲蛋白總量及活性均有很大差異。在選擇某種有機溶劑時，應(yīng)綜合考慮抽提蛋白的質(zhì)量和活性2個指標(biāo)。用混合抽提液抽提粗細(xì)菌素的效果雖然好，蛋白總量最高(2.55 mg)，但是因此造成的活性損失也是最大的，其比活大約只有正丁醇提取物1/4。正丁醇能夠較好地保持蛋白的活性(比活性為5 882 AU/mg)，但抽提的粗細(xì)菌素的含量很低;三氯甲烷抽提的比活性其次，比活性是正丁醇的一半，但是提取的細(xì)菌素的量是正丁醇的20倍，權(quán)衡考慮，采用三氯甲烷抽提細(xì)菌素的效果更好。

3 討論

不同細(xì)菌素很難采用完全相同的分離純化方法。針對純化未知細(xì)菌素，抽提濃縮方法的選擇是關(guān)鍵，靈活采用適當(dāng)?shù)拇痔岱椒?，可大大縮短純化時間，提高純化回收率。硫酸銨沉淀法的性質(zhì)比較溫和，不容易引起蛋白的失活，能夠較大程度地保持蛋白的活性，是運用最廣泛的沉淀方法［9］。本研究發(fā)現(xiàn)利用鹽酸沉淀提取FB123枯草芽胞桿菌細(xì)菌素的方法，相對于傳統(tǒng)的硫酸銨沉淀法能夠更加有效的從發(fā)酵液中沉淀蛋白，提取細(xì)菌素的蛋白總量提高了28.66%，得率提高了10.92%，得到的粗細(xì)菌素的比活性提高了55.46%。酸沉淀法簡便高效，較大程度地簡化了純化步驟，同時在粗提過程中沒有引入鹽離子，有利于后續(xù)的純化步驟，是一種針對細(xì)菌素粗提的有效的沉淀方法。

利用酸沉淀法得到蛋白含量更高的原因有可能是:酸沉淀法能夠?qū)⒘蛩徜@沉淀法所無法沉淀的蛋白或者多肽沉淀下來。硫酸銨法是利用在高離子強度的溶液中，增加了蛋白質(zhì)疏水作用，趨于聚集，達(dá)到溶解極限時沉淀析出?？莶菅堪麠U菌分泌的細(xì)菌素中有很大一部分是多肽，如脂肽或糖肽，分子量較小，硫酸銨沉淀法對于這樣的肽類的沉淀效果不明顯。利用酸沉淀法能夠得到活性更大的細(xì)菌素粗提物的原因有可能是由于酸沉淀法是通過改變粗細(xì)菌素所處的pH環(huán)境，使蛋白或者多肽變性而達(dá)到析出的目的。酸沉淀法能夠更加有效的沉淀發(fā)酵液中的多肽類物質(zhì)，而這類物質(zhì)由于分子量比較小，空間結(jié)構(gòu)比較簡單，性質(zhì)比較穩(wěn)定，不容易變性失活，當(dāng)pH恢復(fù)中性條件時，能夠較好地恢復(fù)活性。

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