大孔樹脂純化蜂膠乙醇提取物中總黃酮的研究

王春玲

（齊魯師范學(xué)院生物系，山東濟(jì)南 250013）

蜂膠是蜜蜂從植物芽孢和枝條上采集的樹脂狀分泌物并混入蜜蜂上顎腺分泌液和蜂蠟等而形成的復(fù)雜物質(zhì)，是蜜蜂用來防護(hù)、抵御病蟲害和病原微生物入侵巢房的御敵物質(zhì)，同時(shí)也是作為修補(bǔ)巢房和內(nèi)環(huán)境消毒殺菌的一種特殊物質(zhì)[1-2]。

蜂膠的化學(xué)組成特征是含有多種類的類黃酮化合物（黃色色素總稱），蜂膠因此被稱為“黃酮類化合物的寶庫”[3]，蜂膠的大部分生理及藥理功能都與此類物質(zhì)有密切關(guān)系[4]。目前世界各地蜂膠樣品中分離出來的黃酮類化合物已有70 多種。蜂膠中的黃酮類化合物主要包括黃酮醇類、黃酮類和黃烷酮類[5-6]。

蜂膠中含有豐富的黃酮類化合物，其品種和含量之豐富，非植物藥所能相比。由于蜂膠的組成成分非常復(fù)雜，乙醇提取液中除黃酮類化合物外還存在著大量的蛋白質(zhì)、可溶性碳水化合物、蜂蠟、脂類芳香油等雜質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)的目的是研究合適的純化工藝，純化蜂膠乙醇提取物，以獲得高質(zhì)量的蜂膠提取物，因此選擇大孔了樹脂吸附法來對(duì)蜂膠的乙醇提取物進(jìn)行分離純化。

1 材料與方法

1.1 主要材料

蜂膠原膠：購自河南福美蜂產(chǎn)品有限公司，經(jīng)乙醇提取后備用。

AB-8、NKA、NKA-9、NKA-Ⅱ型大孔吸附樹脂：購自天津南開大學(xué)化工廠。

1.2 主要試劑

鹽酸、氫氧化鈉、乙醇均為分析純。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品：中國藥品生物制品檢定所。

1.3 主要儀器設(shè)備

THZ-82B 氣浴恒溫振蕩器：江蘇省金壇市醫(yī)療儀器廠；722S 型分光光度計(jì)：上海精密科學(xué)儀器有限公司；BT-100 型蠕動(dòng)泵：上海青浦滬西儀器廠。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 吸附劑的預(yù)處理[7]

將吸附樹脂用乙醇浸泡24 h，傾倒掉上層乙醇，然后加入吸附柱中。待樹脂裝好后，用乙醇以每小時(shí)2倍體積的流速通過樹脂層，至流出液加水不呈白色渾濁為止，并用水以同樣流速洗凈乙醇。然后用2 倍體積的5%的HCl 溶液以2.3 mL/min 的流速通過樹脂層，并浸泡2 h～4 h 后用水以同樣流速洗至流出液pH 呈中性；然后用2 倍體積的2%的NaOH 溶液以2.3 mL/min的流速通過樹脂層，并浸泡2 h～4 h 后用水以同樣流速洗至流出液pH 呈中性。

1.4.2 吸附量的測定[7-8]

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的樹脂100 mg 于250 mL 具塞三角瓶中，精確加入蜂膠乙醇提取液50 mL 置于25 ℃的恒溫氣浴振蕩器上振蕩，振蕩頻率為160 r/min，振蕩48 h，充分吸附后，過濾，測定濾液中剩余黃酮濃度，按下式計(jì)算各樹脂在室溫下的吸附量（mg/g）：

式中：Γ 為大孔樹脂吸附量，（mg/g）；C0為蜂膠提取液總黃酮的起始濃度，（mg/mL）；CR為蜂膠提取液的剩余濃度，（mg/mL）；V 為蜂膠提取液體積，mL；W 為大孔樹脂質(zhì)量，g。

1.4.3 解吸率的測定

吸附樹脂在分離純化物質(zhì)時(shí)是利用吸附的可逆性即解吸。由于樹脂極性不同，吸附作用力強(qiáng)弱不同，解吸難易也不同。因此，解吸劑及其解吸率的測定是樹脂篩選試驗(yàn)的重要環(huán)節(jié)。

按1.4.2 方法充分吸附后的樹脂，分別加入95%乙醇、70%乙醇各100 mL，浸泡48 h，過濾，測定濾液中總黃酮含量，根據(jù)吸附量計(jì)算解吸率（%）。

1.4.4 吸附動(dòng)力學(xué)曲線

在有充分時(shí)間吸附的情況下，有些樹脂可能具有相近的飽和吸附量，但是由于各樹脂化學(xué)和物理結(jié)構(gòu)的差別，其吸附動(dòng)力學(xué)過程是有差異的。準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的各種樹脂400 mg 于250 mL 具塞三角瓶中，精確加入蜂膠乙醇提取液100 mL 置于25 ℃的恒溫氣浴振蕩器上振蕩，振蕩頻率為160 r/min，以吸附劑與蜂膠乙醇提取液接觸時(shí)間為0 時(shí)刻，連續(xù)取樣（1 mL）分析，將t 時(shí)刻溶液中的總黃酮含量Γt 對(duì)t 作圖，得到各樹脂的吸附動(dòng)力學(xué)曲線。

1.4.5 蜂膠乙醇提取液的制備

將粗蜂膠冷凍粉碎后過20 目篩備用。取適量粉碎過篩的蜂膠粉末于錐形瓶中，以乙醇為溶劑在超聲波清洗器中按最佳工藝參數(shù)[9]進(jìn)行提取。

1.4.6 純化工藝的確定

將一定量的經(jīng)預(yù)處理的EEP 溶液上大孔吸附樹脂柱，用蒸餾水洗5 min 使樣品充分分布在柱中，并靜置一段時(shí)間，使樣品盡可能吸附在柱材料上，然后用蒸餾水洗脫除去蛋白質(zhì)、多糖等雜質(zhì)，最后用乙醇解吸并收集洗脫液，濃縮后真空干燥。選取上柱量、吸附時(shí)間、解吸時(shí)間3 個(gè)可能影響純化效果的因素做單因素試驗(yàn)，以所得產(chǎn)品中的總黃酮含量和回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合評(píng)定純化效果，確定純化工藝。

1.4.7 蜂膠乙醇提取物中總黃酮含量的測定－蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線法[10]

精確稱取蘆丁標(biāo)樣0.100 0 g，用乙醇定容至100 mL，混勻后置棕色瓶中。然后用20 mL 移液管移取至100ml 容量瓶中，用乙醇定容，配成0.2 mg/mL 的溶液，吸取該溶液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL，分別置于25 mL 容量瓶中，加水至6.00 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.00 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液1.00 mL，搖勻，靜置6 min，加4.3%氫氧化鈉溶液10.00 mL，加水稀釋至刻度，搖勻，放置15 min。在波長510 nm 處測定吸收度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精確稱取各個(gè)不同純化條件下的蜂膠提取物0.100 0 g，用乙醇定容至100 mL，各取1 mL 分別置于25 mL 容量瓶中加水至6 mL，空白對(duì)照直接加水6 mL 置25 mL 容量瓶中，其余操作同蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 原料液的預(yù)處理

蜂膠中蜂蠟的含量較高，提取液中存在的蜂蠟對(duì)濃縮、分離操作影響較大，利用蜂蠟在冷乙醇中微溶的原理，蜂膠粗提液抽濾后將濾液置冰箱中放置一定時(shí)間然后將絮狀沉淀即蜂蠟和一些蛋白質(zhì)、糖類等過濾除去。

2.2 吸附劑的選擇

合成吸附劑有許多牌號(hào)，不同的吸附劑對(duì)某一類的化合物具有選擇性，選擇性越高，分離得到的化合物的純度就越高。本部分主要研究不同牌號(hào)的吸附劑對(duì)蜂膠中總黃酮的靜態(tài)吸附性質(zhì)和吸附動(dòng)力學(xué)過程，以確定蜂膠中總黃酮的最佳吸附劑。

樹脂在使用前必須進(jìn)行預(yù)處理，以除去樹脂中含有的未聚合的單體、致孔劑（多為長碳鏈的脂肪醇類）、引發(fā)劑、分散劑和防腐劑等，這些物質(zhì)混入制劑中對(duì)人體大都會(huì)產(chǎn)生一定的危害。本實(shí)驗(yàn)所選樹脂的物理性質(zhì)如表1 所示。

表1 吸附樹脂的物理性質(zhì)Table 1 Physical properties of adsorption resin

2.2.1 靜態(tài)吸附量的測定

所選樹脂的靜態(tài)吸附量見表2。

表2 四種大孔樹脂對(duì)蜂膠總黃酮的靜態(tài)吸附量Table 2 Static adsorption capacity on total flavones in the propolis of the four macroporous resin

因?yàn)楸緦?shí)驗(yàn)的目的是要純化蜂膠提取物，因此，就靜態(tài)吸附量來說，吸附量越大越好。從表2 可知各個(gè)樹脂對(duì)總黃酮的靜態(tài)吸附量差異明顯，其中AB-8和NKA-9 吸附量較大，另外兩種樹脂的吸附量較小。

2.2.2 解吸率的測定

合適的吸附樹脂不僅要有較高的吸附量，還要有較好的解析率。所選樹脂的解吸率見表3。

表3 四種大孔樹脂的解吸率Table 3 Desorption rate of the four macroporous resin %

結(jié)果表明不管哪種樹脂，95%的乙醇的解吸效果都好于70%的乙醇，其中AB-8 和NKA-9 的解吸率較高。

2.2.3 靜態(tài)吸附的動(dòng)力學(xué)過程研究

僅用吸附劑的靜態(tài)平衡吸附量來評(píng)價(jià)其吸附性質(zhì)是不全面的，合適的吸附劑不僅應(yīng)當(dāng)有較大的吸附量，較高的解吸率，同時(shí)應(yīng)具有較高的吸附速度，所以有必要比較它們的吸附動(dòng)力學(xué)特征，見圖1。

從圖1 可以看出，四種樹脂的吸附速度差異明顯，NKA-9 和NKA-Ⅱ起始階段的吸附量雖然有大有小，但是達(dá)到吸附平衡的時(shí)間較短，吸附速度較快；而AB-8 和NKA 達(dá)到吸附平衡的時(shí)間較長，為慢速吸附類型樹脂。從吸附量和時(shí)間的關(guān)系看，AB-8 的吸附性能是比較好的。

圖1 四種大孔樹脂對(duì)蜂膠中總黃酮的吸附動(dòng)力學(xué)曲線Fig.1 Adsorption kinetic curve on total flavones in the extraction of propolis of the four macroporous resin

大孔樹脂作用的根本因素是吸附劑與吸附質(zhì)之間的作用力，即范德華力。樹脂的實(shí)際應(yīng)用是由樹脂的極性、平均孔徑、比表面等綜合性能決定的，本研究所用樹脂有非極性、弱極性和極性三種類型。

通過實(shí)驗(yàn)可知，AB-8 和NKA-9 的吸附量較大，這是由于蜂膠中的黃酮類化合物具有多酚結(jié)構(gòu)和糖苷鏈，具有一定的極性和親水性，生成氫鍵的能力較強(qiáng)，有利于弱極性和極性樹脂的吸附。對(duì)于非極性樹脂，即使有較大的孔徑和比表面積（如NKA），吸附量也偏小。但在某些情況下，吸附作用力強(qiáng)不利于解吸，本實(shí)驗(yàn)中NKA-9 的解吸率就小于AB-8。

有機(jī)物通過樹脂的孔徑擴(kuò)散到樹脂孔內(nèi)表面而被吸附。因此樹脂的孔徑大小直接影響不同大小分子的自由出入，從而使樹脂吸附具有一定的選擇性。孔徑太大，樹脂失去了選擇性，孔徑太小，吸附量太小。在孔徑合適，即有良好的擴(kuò)散條件時(shí)，樹脂的吸附量隨比表面的增大而增大，因此AB-8、NKA-9 和NKA-Ⅱ的孔徑雖然相近，但AB-8 的比表面大，因此它的吸附量最大。因此在后面的純化試驗(yàn)中選擇了AB-8 作為吸附劑。

2.3 大孔樹脂純化蜂膠提取物條件的確定

本實(shí)驗(yàn)研究了利用AB-8 型樹脂純化微波法提取的蜂膠中黃酮類化合物的實(shí)驗(yàn)條件，以總黃酮含量和回收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，研究了最佳吸附時(shí)間，最佳解吸時(shí)間，最佳上柱量等幾個(gè)因素，以確定純化工藝條件。

式中：X 為洗脫液中總黃酮濃度，（mg/mL）；V 為洗脫液體積，mL；X樣為上樣樣品中總黃酮濃度，（mg/mL）；V樣為上樣體積，mL。

2.3.1 最佳上柱量的確定

分別吸取黃酮粗提液30、40、50 mL 上大孔樹脂柱，靜置吸附2 h 后先用蒸餾水過柱5 min，再用95%乙醇洗脫，流速為3 mL/min，收集解吸液，測定總黃酮含量和回收率，結(jié)果見表4。

表4 不同上柱量對(duì)總黃酮純化效果的影響Table 4 The purification effect on total flavonoids with various sample size

表4 結(jié)果顯示：隨著上柱量的增加，總黃酮含量不斷增加，而回收率卻不斷下降，當(dāng)上樣量為50 mL 時(shí)，回收率僅為71.6%，這可能是因?yàn)樯蠘恿砍^樹脂的飽和吸附量，在純化過程中直接被洗脫下來，因此綜合考慮總黃酮含量和回收率及處理量，本實(shí)驗(yàn)確定最佳上樣量為40 mL。

2.3.2 最佳吸附時(shí)間的確定

樣品上柱后在柱中的靜置時(shí)間與樣品和柱材料的吸附作用有關(guān)。取靜置時(shí)間1、2、4、8 h 做實(shí)驗(yàn)，上柱量為40 mL，洗脫液濃度為95%，計(jì)算總黃酮含量和回收率，試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 靜置時(shí)間對(duì)總黃酮純化效果的影響Table 5 The purification effect on total flavonoids with different stable time

從表5 可知：靜置時(shí)間在4 h 內(nèi)效果較好，時(shí)間過長或過短效果都不好。這可能時(shí)因?yàn)闀r(shí)間太短時(shí)樹脂吸附不完全，用水洗脫時(shí)有效成分被帶走，而時(shí)間過長又難解吸。綜合考慮最佳吸附時(shí)間為2 h。

2.3.3 最佳解吸時(shí)間的確定

精確吸取樣品液40 mL 上柱，靜置2 h 后，先用蒸餾水洗脫，再用95%乙醇洗脫至有黃色液體出現(xiàn)時(shí)分別靜置0.5、1、2 h 后，再用乙醇洗至流出液成無色為止。收集洗脫液濃縮烘干后計(jì)算總黃酮含量和回收率，結(jié)果見表6。

表6 不同解吸時(shí)間對(duì)純化效果的影響Table 6 The purification effect on total flavonoids with different resolution time

從表6 可知：解吸時(shí)靜置時(shí)間對(duì)純化效果影響不大，因此，在確定整個(gè)工藝條件時(shí)此條件可忽略。

3 結(jié)果討論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)柱材料、上樣量、樣品吸附時(shí)間、解析時(shí)間及乙醇濃度等影響純化的因素進(jìn)行了研究，得出最佳條件為：柱材料為AB-8、上柱量40 mL、樣品吸附時(shí)間為2 h、洗脫液為95%乙醇，經(jīng)驗(yàn)證純化后的蜂膠提取物中總黃酮含量可達(dá)90.1%，得率為87.6%。

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