生物樣品的掃描電鏡制樣干燥方法

肖 媛，劉 偉，汪 艷，左艷霞，胡 銳，李婷婷，崔宗斌

(中國科學院 水生生物研究所，湖北 武漢430072)

0 引 言

應用掃描電鏡觀察生物樣品表面的微小形態(tài)特征，以獲得較光學顯微鏡觀察結(jié)果更為詳盡、細微的結(jié)構(gòu)特征，是生物學研究的重要手段之一。而能否獲得真實、清晰、理想的掃描電鏡觀察結(jié)果，樣品的制備過程是關鍵。

對于常規(guī)的掃描電鏡(Scanning Electron Microscope，SEM)而言，用于觀察的樣品必須是經(jīng)過徹底干燥處理的。含水量高的樣品在掃描電鏡真空的鏡筒中將造成諸多不良后果［1］:①樣品受電子束轟擊后蒸發(fā)的水蒸氣遭遇高能電子流，產(chǎn)生電離而放電，引起束流大幅度波動，使圖像模糊，出現(xiàn)霧狀，或者根本不能成像;②大多數(shù)樣品在高真空中容易發(fā)生形態(tài)損傷，使研究特征皺縮、變形;③造成物鏡、鏡頭、光闌等的污染;④燈絲碰到水蒸氣而氧化變質(zhì)乃至熔斷。雖然近年來出現(xiàn)了環(huán)境掃描電鏡(Environment Scanning Electron Microscope，ESEM)和冷凍掃描電鏡(Cryo-Scanning Electron Microscope，Cryo-SEM)等可觀察含水樣品的掃描電鏡，但上述觀察方法的分辨率較低，因此目前使用較多的還是只能觀察不含水樣品的SEM。

生物樣品的含水量一般為70% ～80%，僅有少數(shù)樣品如毛發(fā)、牙齒、角質(zhì)以及含水量極低的昆蟲等可以直接噴鍍觀察，絕大多數(shù)的生物樣品均要求經(jīng)過干燥處理才能鍍金和進行掃描電鏡觀察［2］。干燥是掃描電鏡生物樣品制備中的關鍵環(huán)節(jié)，如果處理不好，會直接影響到觀察的清晰度與準確度，甚至直接導致試驗失?。?］。要想制備出好的掃描電鏡生物樣品，要求在干燥過程中盡可能減少由于水分蒸發(fā)而引起的樣品表面形貌的變形(體積變化、結(jié)構(gòu)皺縮或干裂等)，且必須確保干燥徹底［1］。大多數(shù)動植物，特別是柔軟的細胞和組織，在干燥時由于體積應力和表面張力的作用，容易發(fā)生明顯的塌陷和變形［2］。因此，需要針對不同的生物樣品來選擇合適的干燥方法，在樣品不受或少受表面張力等因素的影響下，不變地將液體溶劑去掉，達到干燥的目的。

干燥的方法很多，比如臨界點干燥法、自然干燥法、冷凍干燥法、叔丁醇真空干燥法、六甲基二硅胺烷干燥法、乙腈干燥法、烘干干燥法、氮氣干燥法和微波干燥法等［1］。這些方法各有利弊，且適用樣品種類不同。因此，根據(jù)生物樣品的特性選擇一種適宜的干燥方法十分重要。孫京田等也認為干燥方法的選擇是生物醫(yī)學掃描樣品制備中難度最大的一關，他們比較了4 種干燥方法，并分析了各種方法適合的樣品類型［4］。還有一些研究使用某一種或某一類生物材料進行了幾種干燥方法的比較，并指出應根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇相應的干燥方法［3，5-7］。但近年來，沒有任何文獻針對不同種類生物樣品的掃描電鏡樣品干燥方法的選擇進行系統(tǒng)的歸納總結(jié)。本文使用維普期刊和中國知網(wǎng)等數(shù)據(jù)庫，搜索了生物樣品掃描電鏡制樣和觀察的相關文章，共計找到了2001 年以來的122 篇中文文獻，重點比較分析了不同生物樣品所采用的不同干燥方法，并對微生物、植物或動物樣品干燥方法的一般性選擇原則進行歸納和總結(jié)，以期為研究人員選擇掃描電鏡制樣方法提供幫助。

1 掃描電鏡生物樣品制備常用干燥方法

1.1 自然干燥法

自然干燥法是指樣品中的水分在大氣中自然蒸發(fā)，或樣品經(jīng)脫水處理后脫水劑自然揮發(fā)而干燥的方法。樣品從含脫水劑狀態(tài)下進行自然干燥與樣品從含水狀態(tài)下進行自然干燥相比，由于脫水劑的表面張力系數(shù)小于水，所以前者樣品變形較?。?］。自然干燥法對于含水量較多的動植物組織、游離細胞等的干燥是不適用的，因為干燥過程中表面張力將使樣品變形。自然干燥法對干種子、果殼、某些干花粉、長期保存的昆蟲針插標本和70%乙醇浸泡的昆蟲標本以及蛋殼和蛋膜等樣品是一個簡易實用有效的方法，雖然在自然干燥過程中，樣品體積有所收縮，但卻保留了樣品的基本形態(tài)［1］。

1.2 烘干干燥法

此方法將要研究的樣品用烘干箱烘干，一般溫度控制在80℃以下，烘干程度以含水量在5%以下為好。此方法的干燥速度較快，但水分蒸發(fā)時可能造成樣品變形或微小斷裂。適用于不易變形且耐熱的樣品，比如淀粉粒、孢子粉等［1］。

1.3 臨界點干燥法

此方法是根據(jù)物質(zhì)處在臨界點時的特殊物理狀態(tài)設計的一種干燥方法。在臨界狀態(tài)下，液體和氣體的密度相等，氣液界面完全消失，液體的表面張力系數(shù)為零［1］。臨界點干燥法之所以一直被視為制作生物醫(yī)學掃描樣品最可靠的干燥方法，是因為此法能消除液體表面張力的作用，干燥出的樣品能最大程度地保存其自然形態(tài)［4］。臨界點干燥法適合多種生物樣品的干燥。

1.4 冷凍干燥法

冷凍干燥法是利用低溫和真空，使樣品中的水分直接由冰升華，或經(jīng)過某種升華介質(zhì)由固相升華，以達到干燥樣品的目的［1］。冷凍干燥過程使水分從固態(tài)直接轉(zhuǎn)化為氣態(tài)，不經(jīng)過液態(tài)階段，因而避免了氣相和液相之間表面張力對樣品的損傷［2］。根據(jù)選用的冷凍介質(zhì)的不同，冷凍干燥法又可以分為從水中直接冷凍干燥和從有機溶劑中干燥。與水相比，有機溶劑在冰凍后形成非晶體固態(tài)，不會產(chǎn)生冰晶損傷樣品，且能以最快的速度從固態(tài)升華，大為縮短了干燥時間［2］。

1.5 真空干燥法

真空干燥法指的是將經(jīng)脫水的樣品置于真空容器中進行干燥的方法。真空干燥法選用高熔點的有機材料(叔丁醇、乙腈、六甲基二硅胺烷、正丁醇等)作升華介質(zhì)，既保留了冷凍干燥法的優(yōu)點，又不用對樣品進行冷凍處理，無冷凍損傷，且操作簡單［1］。最常用的真空干燥法是以叔丁醇為升華介質(zhì)的叔丁醇干燥法，乙腈干燥法、六甲基二硅胺烷干燥法、正丁醇干燥法等用的相對較少(下文將叔丁醇真空干燥簡稱為叔丁醇干燥)。

總之，如表1 所示，上述5 種干燥方法各有優(yōu)缺點，且適合于不同的生物樣品種類。一般認為目前在用的最好的干燥方法是臨界點干燥法;其次是冷凍干燥法、真空干燥法和自然干燥法［2］。雖然干燥方法在不斷改進，但還是只能把由干燥引起的樣品變形控制在一定的范圍內(nèi)。臨界點干燥法被認為是一種最理想的干燥方法，但仍存在大約5%的變形［1］。有研究結(jié)果表明，叔丁醇干燥法對有些材料來說可與臨界點干燥相媲美，而且前者具有操作簡便，叔丁醇可代替酒精做脫水劑，可同時干燥較大量的樣品，樣品不易被污染、安全可靠、所需儀器常規(guī)實驗室均有配備等優(yōu)點［8］。孫京田等發(fā)現(xiàn)采用叔丁醇干燥法干燥的各種動、植物樣品各項指標均較理想，與臨界點干燥法的效果基本相同，因此認為叔丁醇干燥法也是制作生物、醫(yī)學掃描樣品時首選的干燥方法［4］。郭素枝等考慮到叔丁醇干燥法的諸多優(yōu)點，建議在沒有臨界點干燥儀的情況下采用叔丁醇干燥法［8］。在實際應用中，應該根據(jù)不同的樣品和實驗目的來選擇不同的干燥方法，最好參照文獻選擇針對特異樣品的干燥方法。

表1 5 種常用生物樣品干燥方法的比較

2 微生物、植物和動物的SEM 樣品干燥方法

2.1 微生物

如表2、3 所示，在數(shù)據(jù)庫中共搜索到2005 年以來的11 篇相關文獻。對于微生物樣品，使用各種干燥方法均取得過滿意的觀察結(jié)果，各方法的選擇沒有明顯的偏向性。總的來說臨界點干燥法和叔丁醇干燥法應用得較多，但細菌、霉菌和真菌都可以選用操作較為簡單的自然干燥法或烘干干燥法。孔祥林等在制備貴陽腐霉的掃描電鏡樣品時，采用了自然干燥的方法，同時他們也指出低溫天氣時可用鼓風干燥箱30 ℃干燥，即使用烘干干燥法［9］。表明對于貴陽腐霉來說，自然干燥和烘干干燥的效果沒有明顯區(qū)別。錢天樂等比較了經(jīng)室內(nèi)晾干、烘箱干燥和叔丁醇真空干燥處理后的大腸桿菌的形態(tài)和制樣處理效果，發(fā)現(xiàn)叔丁醇真空干燥對樣品脫水最充分、造成的破壞和變形最小，而且干燥越充分樣品的掃描電鏡圖像越清晰，由此認為對單細胞生物采用叔丁醇干燥法要比自然晾干和烘干脫水更徹底、成像更理想［7］。對于細菌、細胞一類微小的樣品，采用臨界點和冷凍干燥法較難操作，但若采用固定、脫水之后將樣品點于蓋玻片上再真空干燥的方法，效果還是比較理想的，而且方便操作［1］?？傊?，對于微生物等微小的生物樣品，如果想要操作簡便，可以選用自然干燥法或烘干干燥法;如果想要獲得較好的效果，建議選用臨界點干燥法或真空干燥法。

表2 微生物樣品的掃描電鏡制樣干燥方法與研究時間的關系

表3 不同種類微生物樣品的掃描電鏡制樣干燥方法

2.2 植 物

綜合2004 年以來的數(shù)據(jù)，在對植物樣品進行干燥時，研究者選用最多的方法是臨界點干燥法，然后是自然干燥法和叔丁醇干燥法(見表4)。從文獻的時間來看，自然干燥法和臨界點干燥法是兩種比較傳統(tǒng)的干燥方法，應用最為廣泛，自2004 年起基本每年都有文獻;叔丁醇干燥法和冷凍干燥法作為較新的干燥方法，近年來才開始獲得廣泛的應用。有8 篇文獻未對植物樣品進行任何干燥就放入掃描電鏡觀察，其中5 篇關于花粉使用的是常規(guī)電鏡，2 篇關于葉片使用的是環(huán)境掃描電鏡，1 篇關于全株使用的是冷凍掃描電鏡。需要特別指出的是，只有花粉的文獻是真正意義上的未干燥，其余3 篇文獻則是由于使用了特殊類型的掃描電鏡。

共有15 篇文獻是關于花粉的研究，其中5 篇未干燥，4 篇采用自然干燥法，6 篇采用臨界點干燥法(見表5)。一般來說，花粉本身含水量較少且外表不易變形，多采用自然干燥法。蔡秀珍等認為雖然花粉有堅硬的外壁，但如果直接通過野外日曬或室內(nèi)烘箱烘干來干燥，脫水過程過于劇烈，不利于花粉表面微觀結(jié)構(gòu)的保存，而用酒精系列梯度脫水后再自然干燥則可得到較為理想的制樣效果［10］。也有些植物的花粉組織幼嫩，本身含水分較多，在自然干燥處理過程中容易因為表面張力的作用，使得其表面結(jié)構(gòu)發(fā)生皺縮、塌陷、變形。陳新芳等的研究就表明自然干燥法不適合用于五指毛桃花粉的掃描電鏡樣品制備，而臨界點干燥法制備的花粉表面干凈、形態(tài)清晰飽滿、基本無變形，立體感強［11］。

表4 植物樣品的掃描電鏡制樣干燥方法與研究時間的關系

表5 不同種類植物樣品的掃描電鏡制樣干燥方法

續(xù)表5

也許是因為植物樣品的掃描電鏡制樣較為簡單，關于其干燥方法的比較研究的文獻較少。本文總結(jié)的文獻中，僅有曹君邁等比較了微波干燥、液氮干燥、真空冷凍干燥、叔丁醇干燥4 種方法處理植物花蕾的效果，結(jié)果表明叔丁醇干燥法效果最好［3］。一般來說，含水量較少、細胞壁和蠟質(zhì)層較厚的植物組織多采用自然干燥法，而幼嫩、含水分較多的組織則需要選擇其他方法。臨界點干燥法和叔丁醇干燥法幾乎適用于各類型的植物樣品，但是考慮到操作的復雜性，能使用更簡便的干燥方法時一般不選用它們。

2.3 動 物

對于動物樣品來說，臨界點干燥法是首選的干燥方法，約60%的查閱文獻使用了該方法，其次是自然干燥法和真空干燥法(見表6)。文獻主要集中于線蟲動物門、節(jié)肢動物門和脊索動物門，且不同動物門的生物樣品的干燥方法的選擇略有區(qū)別(見表7)。

表6 動物樣品的掃描電鏡制樣干燥方法與研究時間的關系

表7 不同種類動物樣品的掃描電鏡制樣干燥方法

續(xù)表7

續(xù)表7

線蟲最常被用作為研究掃描電鏡制樣干燥方法的材料。浦衛(wèi)瓊等比較了自然干燥法和臨界點干燥法對柑桔寄生線蟲的干燥效果，經(jīng)比較認為用臨界點干燥法制樣效果較好，蟲體表面環(huán)紋、側(cè)線、陰門、肛門、交合刺等明顯易見，清晰度好［12］。郭素枝等以甘薯莖線蟲為材料進行的研究表明，臨界點干燥法的可觀察率略高于叔丁醇干燥法，但兩種方法的制樣效果都較好，能獲得良好的微形態(tài)結(jié)構(gòu)，側(cè)線數(shù)目清晰，蟲體不皺縮、不變形［8］。李蕾等認為對線蟲而言，叔丁醇干燥法的效果比臨界點干燥法好［6］。

郭素枝等以節(jié)肢動物門生物繭蜂和蚜蟲為材料，比較了6 種干燥方法分別對含水量低(酒精浸泡標本、針插標本及蚜蟲前胸背板)和含水量高(蚜蟲腹部)的昆蟲樣品的制樣效果［5］。結(jié)果表明，相同試樣采用不同的干燥法，其效果大不相同:①對含水量高的蚜蟲腹部，叔丁醇干燥法可與臨界點干燥法相媲美，且前者操作更簡便，而其他干燥方法會引起蟲體變形，只是變形程度有所差異;②對含水量低的蚜蟲前胸背板等樣品，幾種干燥方法均不見變形，建議采用最經(jīng)濟省時的自然干燥法。因此，對于節(jié)肢動物門生物來說，含水量低且觀察部位相對較硬的樣品多采用自然干燥法，而含水量高且較柔軟的樣品多采用臨界點干燥或真空干燥法。

脊索動物門樣品采用最多的是臨界點干燥法，少數(shù)含水量極低且較硬的樣品如鱗片、毛發(fā)可使用簡單的自然干燥法。未找到以脊索動物門樣品為材料進行不同干燥方法制樣效果研究的文獻，因此不知道叔丁醇干燥法與臨界點干燥法效果的異同。但叔丁醇干燥法在對鼠紅細胞［13］、人干細胞［14］、人杯狀細胞［15］、鼠腸粘膜［16-17］等的研究中取得了滿意的觀察效果。

3 結(jié) 語

在進行掃描電鏡生物樣品制備時，應根據(jù)生物樣品的特性、觀察要求和設備條件來選擇采用何種干燥方法。通過以上分析，我們提出以下掃描電鏡生物樣品干燥方法選擇的一般性原則:

(1)對于微生物等微小的生物樣品，如果想要操作簡便，可以選用自然干燥法或烘干干燥法;如果想要獲得較好的效果，建議選用臨界點干燥法或真空干燥法。

(2)一般來說，含水量較少、細胞壁和蠟質(zhì)層較厚的植物組織多采用自然干燥法，而幼嫩、含水分較多的組織則需要選擇其他方法。臨界點干燥法和叔丁醇真空干燥法幾乎適用于各類型的植物樣品，但是考慮到操作的復雜性，能使用更簡便的干燥方法時一般不選用它們。

(3)臨界點干燥法是動物樣品的首選干燥方法?？紤]到操作的簡便性，對于含水量低且觀察部位相對較硬的動物樣品也可以采用自然干燥法，但是含水量高且較柔軟的樣品推薦采用臨界點干燥或叔丁醇真空干燥法。

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