IL-17和IFN-γ在紅內(nèi)期間日瘧原蟲感染者外周血T細(xì)胞亞群中的表達(dá)

孔評石夏惠

IL-17和IFN-γ在紅內(nèi)期間日瘧原蟲感染者外周血T細(xì)胞亞群中的表達(dá)

孔評石1,2夏惠2★

目的 觀察分析間日瘧原蟲感染患者外周血T細(xì)胞亞群中分泌IL-17和IFN-γ的細(xì)胞的表達(dá)水平。 方法 采用流式細(xì)胞術(shù)檢測分析患者組（PV）和健康對照組（HD）外周血CD3+、CD3+CD8+、CD3+CD8-和γδT細(xì)胞中分泌胞內(nèi)因子IL-17、IFN-γ的細(xì)胞的百分比。 結(jié)果 在所有檢測的細(xì)胞亞群中，分泌IFN-γ的CD3+CD8-和γδT細(xì)胞在其所屬亞群中所占比例明顯高于健康對照組，分泌IL-17的γδT細(xì)胞的比例明顯高于健康對照組。 結(jié)論 本研究對于理解機(jī)體抗瘧原蟲的細(xì)胞免疫的功能狀態(tài)具有一定意義。

IL-17；IFN-γ；γδT細(xì)胞；間日瘧原蟲1,22★

瘧疾是危害人類最嚴(yán)重的寄生蟲病。盡管近年來瘧疾防治工作取得了重要進(jìn)展，但惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum，Pf）每年仍造成數(shù)十萬患者死亡[1]。間日瘧是最廣泛傳播的蟲種，亦是我國主要的流行蟲種，但長期以來對間日瘧的免疫機(jī)制研究不夠深入。

瘧疾的抗感染免疫機(jī)制中存在著復(fù)雜的細(xì)胞因子效應(yīng)。在以往的研究中表明IFN-γ、TNF-α、IL-12、 IL-6等多種細(xì)胞因子在抗瘧原蟲感染中發(fā)揮了重要作用，其中IFN-γ在抗瘧原蟲感染和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用。近年來，IL-17在感染免疫中的作用受到越來越多的認(rèn)識，但在瘧疾感染中的表達(dá)狀況卻少見報(bào)道。本研究通過對間日瘧原蟲紅內(nèi)期現(xiàn)癥感染者外周血T細(xì)胞亞群分泌IL-17和IFN-γ的特征進(jìn)行觀察分析，旨在了解間日瘧感染中的細(xì)胞因子表達(dá)特征，從而進(jìn)一步理解間日瘧感染中細(xì)胞免疫和調(diào)節(jié)的機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象

24例間日瘧患者（PV）全血采自蚌埠市周邊縣區(qū)醫(yī)院?；颊呓?jīng)鏡檢診斷為紅內(nèi)期間日瘧原蟲感染，用肝素抗凝管抽取血樣于37℃保溫4 h內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，經(jīng)鏡檢復(fù)檢確認(rèn)的血樣用于實(shí)驗(yàn)。23例健康志愿者（HD）外周血取自蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)生和教師。所有人群均排除肝炎與結(jié)核病史。

1.2 主要試劑和設(shè)備

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備

HW0301T-VBA型CO2培養(yǎng)箱：美國Harris公司。FACSCalibur流式細(xì)胞儀：美國BD公司。

1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑

熒光標(biāo)記鼠抗人單克隆抗體：抗IFN-γ-FITC，抗IL-17A FITC，抗TCRγδ-PE,抗CD3 -PERCP，抗CD8-APC均為eBioscience公司產(chǎn)品。以上均為小鼠抗人單克隆抗體。佛波醇酯（PMA）、 鈣離子霉素（Ionomycin）、莫能霉素（monesin）為Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 間日瘧患者組和健康對照組細(xì)胞因子的激發(fā)和阻滯

所有樣本均取1 mL全血加1 mL含10%小牛血清的RPMI1640稀釋，置于48孔培養(yǎng)板，加入20 ng/mL佛波醇酯和500 ng/mL鈣離子霉素置5%CO2培養(yǎng)箱刺激6 h（37℃，飽和濕度），并于刺激2 h后加入2.5 mol/L莫能霉素繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后收集細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞染色。1.3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測分析胞內(nèi)因子

流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞因子按照常規(guī)方法進(jìn)行，同時(shí)設(shè)置同型對照組。具體如下：100 μL患者和對照者壓積全血（各分兩管）加入PeCy5.5標(biāo)記的抗CD3抗體、APC標(biāo)記的抗CD8抗體和PE標(biāo)記的抗TCR-γδ抗體，4℃ 避光反應(yīng)20 min，加入溶血?jiǎng)˙D Biosciences）室溫避光溶解紅細(xì)胞10 min，染色緩沖液（PBS-5%NBS-0.1% NaN3）洗兩次，2%多聚甲醛4℃固定30 min，染色緩沖液洗兩次，透膜緩沖液（PBS-10%NBS-0.1%皂素）4℃避光透膜15 min， 5%牛血清白蛋白和10%小鼠血清4℃避光封閉30 min，兩管分別加入FITC標(biāo)記的抗IL-17A抗體和FITC標(biāo)記的抗IFN-γ抗體，同型對照管加抗小鼠IgG1 FITC，4℃避光反應(yīng)30 min，透膜緩沖液洗兩次，染色緩沖液洗一次，用2%的多聚甲醛200 μL重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀檢測。應(yīng)用CellQuest和WinMDI 2.8軟件分析流式檢測結(jié)果，非特異性吸附從同型對照中減去。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析檢測結(jié)果，顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為0.05，用SPSS13.0軟件完成。

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ在患者T細(xì)胞亞群中的表達(dá)

經(jīng)分析，我們在對間日瘧患者全部的外周血淋巴細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞和CD3+CD8+T亞群的觀察中沒有發(fā)現(xiàn)分泌IFN-γ的陽性細(xì)胞比例的變化，但發(fā)現(xiàn)患者組CD3+CD8-T細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞比例（4.52±2.26%）顯著高于對照組（2.71±1.04%），同時(shí)發(fā)現(xiàn)患者組γδ T細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞所占的比例（13.52±5.32%）亦顯著高于對照組（7.43±4.15%），見圖1、圖2。

2.2 IL-17在患者T細(xì)胞亞群中的表達(dá)

圖1 用流式細(xì)胞術(shù)分析一例間日瘧感染患者和健康對照者外周血T細(xì)胞亞群的胞內(nèi)因子Figure1 Using FACS to study the intra-cellular cytokines in T cell subsets of the peripheral blood from a PV patient and that from HD.

圖2 患者組和健康對照組T細(xì)胞亞群中分泌IFN-γ的細(xì)胞比例的比較Figure2 Comparison of the proportions of cells secreteing IFN-γ in T cell subsets in PV and HD

圖3 患者組和健康對照組T細(xì)胞亞群中分泌IL-17的細(xì)胞比例的比較Figure3 Comparison of the proportions of cells secreteing IL-17 in T cell subsets in PV and HD

在對全部的CD3+T細(xì)胞、CD3+CD8+T細(xì)胞和CD3+CD8-T細(xì)胞亞群的分析中沒有發(fā)現(xiàn)分泌IL-17的陽性細(xì)胞比例的顯著變化，但間日瘧患者γδ T細(xì)胞中分泌IL-17的細(xì)胞所占的比例（5.88±2.13%）顯著高于對照組（3.77±1.73%），見圖1、圖3。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：急性期瘧疾患者血循環(huán)中T細(xì)胞亞群表現(xiàn)出胞內(nèi)因子分泌模式的顯著變化，其中γδ T細(xì)胞分泌IL-17和IFN-γ顯著增高，而在CD3+CD8-T細(xì)胞中分泌IFN-γ的陽性細(xì)胞的比例增加更為顯著。

3 討論

瘧疾感染中的免疫機(jī)制研究一直受到普遍關(guān)注。以往的研究表明瘧原蟲感染中存在著復(fù)雜的細(xì)胞免疫機(jī)制和細(xì)胞因子效應(yīng)。急性瘧疾感染中作為效應(yīng)細(xì)胞的T細(xì)胞亞群分泌IFN-γ、TNF-α、IL-1和IL-12等細(xì)胞因子發(fā)揮了重要的抗感染作用。對惡性瘧和鼠瘧模型的研究揭示了IFN-γ在免疫保護(hù)和病理損傷中均處于中心的位置，及時(shí)而適當(dāng)強(qiáng)度的IFN-γ響應(yīng)是有效的抗原蟲反應(yīng)的表現(xiàn)[2～3]。最早的IFN-γ是由NK細(xì)胞開始分泌，隨后是γδT細(xì)胞 （24～48 h），最后是αβT細(xì)胞（4～6天后）分泌。這些T細(xì)胞亞群細(xì)胞分泌的IFN-γ在生理濃度下誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化以增強(qiáng)吞噬和殺傷感染紅細(xì)胞[4]，但I(xiàn)FN-γ激活巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-1、IL-6等導(dǎo)致炎癥級聯(lián)放大效應(yīng)[5]。長期的高水平炎性因子將導(dǎo)致機(jī)體免疫損傷和重癥瘧疾的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)證實(shí)在惡性瘧重癥患者的PBMC培養(yǎng)上清和血漿中IFN-γ的水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無癥狀患者[6]。以往的IFN-γ研究多集中于Pf和鼠瘧感染模型實(shí)驗(yàn)，直接針對p.v的細(xì)胞免疫研究較為欠缺。

IL-17是一種重要的促炎性細(xì)胞因子，相關(guān)研究報(bào)道了IL-17能夠通過招募和活化中性粒細(xì)胞、促進(jìn)促炎性細(xì)胞因子、趨化因子及抗體的生成以及激活T細(xì)胞等功能對細(xì)菌、真菌、病毒等病原體發(fā)揮重要的抗感染作用和免疫調(diào)節(jié)作用[7～9]。近年來的諸多證據(jù)表明IL-17在寄生蟲感染免疫中同樣發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，給感染肺孢子蟲的野生型小鼠注射抗IL-17的中和抗體后導(dǎo)致使感染小鼠體內(nèi)的蟲荷增加，表明了IL-17的保護(hù)性作用[10]；同時(shí)作為促炎性因子IL-17在炎性病理中亦扮演了重要角色。感染曼氏血吸蟲繼而用可溶性血吸蟲卵抗原免疫的小鼠會由IL-17介導(dǎo)發(fā)生炎性肉芽腫，導(dǎo)致嚴(yán)重的免疫病理損傷[11]。IL-17受體缺損的小鼠對剛地弓形蟲易感性提高，但同時(shí)病理損傷亦減輕，同樣證明了寄生蟲可通過誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的IL-17應(yīng)答參與免疫病理過程[12]。盡管現(xiàn)有的證據(jù)似乎足以證實(shí)IL-17在寄生蟲感染免疫過程中至關(guān)重要的保護(hù)性和炎性病理的雙向效應(yīng)，但I(xiàn)L-17在瘧疾免疫中扮演的角色至今很少受到關(guān)注。

我們先前在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，間日瘧患者血清中的IFN-γ和IL-17均顯著高于健康對照者，提示IFN-γ和IL-17均參與了抗p.v免疫應(yīng)答，但增高的細(xì)胞因子來源并不清楚。在本實(shí)驗(yàn)中對T細(xì)胞亞群分泌細(xì)胞因子的觀察中我們發(fā)現(xiàn)，間日瘧原蟲感染者分泌IFN-γ的CD3+CD8-T細(xì)胞比例顯著高于健康對照組，分泌IL-17和IFN-γ的γδT細(xì)胞比例亦顯著高于對照組，部分顯示了在p.v感染中細(xì)胞因子來源的特定模式。Bueno等[13]最近在對美洲間日瘧感染者的研究中發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生IL-17的CD4+T細(xì)胞在美洲間日瘧急性感染病人外周血中顯著增加，并與產(chǎn)生IFN-γ的CD4+T細(xì)胞數(shù)量密切相關(guān)，該結(jié)果提示產(chǎn)生IFN-γ和IL-17的T細(xì)胞亞群參與的細(xì)胞因子效應(yīng)的平衡在保持適度的炎性響應(yīng)和控制原蟲血癥的發(fā)展中具有重要意義，亦在一定程度上與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相為佐證。

以往的研究已經(jīng)證實(shí)γδT細(xì)胞是IFN-γ的重要來源，近年來越來越多的證據(jù)表明γδT細(xì)胞也是IL-17的重要來源。Schulz等[7]發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞通過分泌IL-17在沙門氏菌腸炎的保護(hù)性免疫中發(fā)揮效應(yīng)；Peng等[14]認(rèn)為結(jié)核病人中異常增多的分泌IL-17的γδT細(xì)胞參與了抗結(jié)核免疫和結(jié)核病的病理過程。本實(shí)驗(yàn)通過對胞內(nèi)因子的檢測分析初步顯示了IL-17和IFN-γ在各淋巴細(xì)胞亞群表達(dá)狀況，證明了在間日瘧感染中作為非特異性免疫的重要組成部分的γδT細(xì)胞是IL-17和IFN-γ的重要來源，同時(shí)CD3+CD8-T細(xì)胞也是IFN-γ的重要來源。這種分泌IL-17和IFN-γ的細(xì)胞比例的增多在間日瘧感染過程中是發(fā)揮協(xié)同保護(hù)性的作用抑或傾向于造成炎性病理損傷仍有待于進(jìn)一步的確認(rèn)；而是否能夠在病程的不同階段通過干預(yù)T細(xì)胞亞群的細(xì)胞因子分泌來有效地控制原蟲血癥和降低炎性病理的發(fā)生亦有待于更深入的研究。

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Expressions of IL-17 and IFN-γ in the T cell subset in the peripheral blood of patients infected with blood-stage plasmodium vivax

KONG Pingshi, XIA Hui
(1.The Second Tranditional Chinese Medicine Hospital of Jiangsu, Jiangsu, Nanjing 210017, China; 2.Pathogen Biology Laboratory of Bengbu Medical College, Anhui, Bengbu, 233030, China)

Objective To investigate the expressions of T cell subset which secretes IL-17 or IFN-γ in the peripheral blood of patients infected withplasmodium vivax (p.v). Methods Using FACS to detect the proportion of the cells secreteing intra-cellular cytokines IL-17 or IFN-γ of CD3+, CD3+CD8+, CD3+CD8-and γδT cells in the T cell subset of peripheral blood from patients infected withp.vand healthy donors. Results Among all of the detected T cell subsets of PV, the proportion of the CD3+CD8-T cells and γδT cells secreteing IFN-γ and the γδT cells secreteing IL-17 were higher than that of HD. Conclusion This analysis furthers people's understanding of the function of anti-p.vcellular immunity of human beings.

IL-17; IFN-γ; γδT;Plasmodium vivax

安徽省教育廳自然科學(xué)研究重點(diǎn)資助項(xiàng)目（kj2012-A-200）

1.江蘇省第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇，南京 210017 2.蚌埠醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，安徽，蚌埠 233030

★通訊作者：夏惠，E-mail: landsky0330@163.com