產(chǎn)抗生素南極海洋放線菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

彭 彬,孫 超

(濰坊科技學(xué)院化工與環(huán)境學(xué)院,山東壽光262700)

產(chǎn)抗生素南極海洋放線菌的篩選及培養(yǎng)條件優(yōu)化

彭 彬,孫 超

(濰坊科技學(xué)院化工與環(huán)境學(xué)院,山東壽光262700)

對32株南極海洋放線菌進行抑菌活性實驗,篩選出3株具有一定抑菌活性的放線菌,分別命名為GD-F1、GD-F2和GD-F3,其中GD-F2的抑菌活性較高;探討了碳源、氮源、p H值等條件對GD-F2產(chǎn)抗生素的影響,確定GD-F2產(chǎn)抗生素的最佳培養(yǎng)條件為:碳源為可溶性淀粉、氮源為大豆粉或酵母膏、用天然海水和蒸餾水各一半配制培養(yǎng)基、無機鹽濃度為改良高氏一號培養(yǎng)基的一半、p H值為7.0,為南極海洋放線菌的機理研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

南極海洋放線菌;抗生素;分離篩選

自1988年Dvide等首次從南極土壤中分離出具有溶菌能力、溶瓊脂能力的嗜冷型粘細菌開始,科研工作者已經(jīng)將篩選新的抗腫瘤的活性物質(zhì)的目標(biāo)轉(zhuǎn)向了極地海洋微生物。從極地海洋環(huán)境中篩選放線菌及其產(chǎn)生的新型抗生素不僅具有較高的學(xué)術(shù)價值,同時具有良好的社會和經(jīng)濟效益[1-5]。

作者對中國第十九次南極科學(xué)考察采集的32株南極海洋放線菌進行了抑菌活性的篩選,獲得具有一定抑菌活性的3株放線菌,探討了高產(chǎn)抗生素菌株的最優(yōu)培養(yǎng)條件,為南極海洋放線菌的機理研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌株、試劑與儀器

南極海洋放線菌,于中國第十九次南極科學(xué)考察采集樣品中分離獲得。金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙堡菌、枯草芽孢桿菌,自行保藏。

葡萄糖,乳糖,蔗糖,可溶性淀粉,玉米粉,大豆粉,酵母膏,蛋白胨,硫酸銨,MgSO4·7H2O,K2HPO4, KNO3,FeSO4·7 H2O,鹽酸,氫氧化鈉,乙酸乙酯(分析純);TE緩沖溶液(p H值8.0):10 mmol·L-1Tris-HCl,1 mmol·L-1EDTA;10%(質(zhì)量濃度) CTAB(十六烷基三乙基溴化銨)溶液:在80 m L雙蒸水中溶解4.1 g氯化鈉,緩慢加入10 g CTAB,同時加熱至65℃并攪拌,定容終體積至100 m L;緩沖溶液: 0.25%溴酚藍,40%(質(zhì)量濃度)蔗糖水溶液。

高速離心機,真空泵,恒溫水浴,電動旋轉(zhuǎn)儀, PTC-100型PCR儀(M J Research),熒光顯微鏡。

1.2 培養(yǎng)基

(1)分離培養(yǎng)基采用葡萄糖、天冬素瓊脂和營養(yǎng)瓊脂,加0.5%甘油、3 mg·m L-1鏈霉素和100 mg· m L-1制霉菌素。

(2)改良高氏一號培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基):KNO31 g,K2HPO40.5 g,FeSO4·7 H2O 0.01 g,MgSO4· 7H2O 0.5 g,可溶性淀粉20 g,大豆粉(酵母膏)20 g,瓊脂20 g,陳海水500 m L,蒸餾水500 m L。調(diào)節(jié)p H值7.4～7.6,121℃下高壓蒸汽滅菌20 min。

(3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基:甘油3%,葡萄糖0.2%,土豆淀粉0.2%,黃豆餅粉2.0%,全血胨0.3%,干酵母0.5%,陳海水配制。

(4)沙氏培養(yǎng)基:蛋白胨1%,葡萄糖4%,瓊脂1.6%,陳海水配制。

1.3 方法

1.3.1 南極海洋放線菌的分離

(1)取1 m L底泥,加4 m L無菌天然海水,55℃保溫6 min,涂平板。

(2)取10 m L底泥樣品鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi),真空干燥約24 h,磨細成粉末;或者將底泥樣品鋪于無菌培養(yǎng)皿內(nèi),25～28℃自然干燥5～7 d,磨碎,80℃或120℃干熱處理60 min。用無菌天然海水提取菌體并稀釋,涂平板。

1.3.2 產(chǎn)抗生素南極海洋放線菌的篩選

(1)種子液的制備:向改良高氏一號培養(yǎng)基中加入重鉻酸鉀至50 mg·kg-1,用平板稀釋涂抹法分離目的菌株。15℃培養(yǎng)14 d,根據(jù)菌落形態(tài)選取不同菌株,經(jīng)純化后轉(zhuǎn)接至改良高氏一號斜面上,15℃培養(yǎng)7 d。

(2)瓊脂挖塊接種于裝有50 m L種子培養(yǎng)液的250 m L三角瓶中,于15℃旋轉(zhuǎn)搖床上培養(yǎng)48 h作為種子,以10%接種量種入兩個分別裝有250 m L發(fā)酵培養(yǎng)基的500 m L三角瓶中,于15℃往復(fù)式搖床上培養(yǎng)7 d后,收集發(fā)酵液。

1.3.3 抑菌活性測定

(1)將濾紙片分別放入兩個平板培養(yǎng)皿中,110℃高壓滅菌20 min,制成無菌濾紙片;

(2)將濃縮液1與濃縮液2分別倒入兩個培養(yǎng)皿中,充分浸泡無菌濾紙片,37℃烘干;

(3)將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和沙堡菌菌液稀釋至1×108個·m L-1,取15 m L稀釋菌液加入到50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基中混勻,然后倒平板備用;

(4)將無菌濾紙片置于涂布有各靶標(biāo)菌的平板培養(yǎng)基中,每平板內(nèi)對稱放置4片,28℃恒溫培養(yǎng)3 d后觀察,篩選具有抑菌活性的放線菌。

1.3.4 GD-F2培養(yǎng)條件的優(yōu)化

選擇抑菌活性最高的菌株,考察不同碳源、氮源、鹽濃度、無機鹽濃度、p H值對其產(chǎn)抗生素的影響,優(yōu)化培養(yǎng)條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株篩選

二是，引入“中國夢”宣傳教育可以提高大學(xué)生的歷史責(zé)任感〔3〕?，F(xiàn)階段，隨著人們生活水平的提高，部分大學(xué)生已經(jīng)養(yǎng)成了浪費的習(xí)慣，且缺乏歷史責(zé)任感，不能正確認識自身肩上所承擔(dān)的歷史責(zé)任。面對此種情況，各個大學(xué)就需要積極引入“中國夢”宣傳教育，通過此項工作，讓大學(xué)生可以正式自身歷史使命，主動承擔(dān)民族建設(shè)責(zé)任，從而為“中國夢”的實現(xiàn)貢獻出自身力量。

活性實驗結(jié)果表明,有3株南極海洋放線菌具有一定的抑菌活性,分別命名為GD-F1、GD-F2和GDF3,如表1所示。

表1 南極海洋放線菌GD-F1、GD-F2、GD-F3的抑菌活性Tab.1 The antibiotic activity of GD-F1,GD-F2,GD-F3

由表1可知,GD-F1和GD-F3對金黃色葡萄球菌具有一定的抑制作用,但活性不高;GD-F2對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有較好的抑制作用。因此,選擇GD-F2進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化。

2.2 GD-F2培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.2.1 不同碳源對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響

分別以1%的葡萄糖、乳糖、蔗糖、可溶性淀粉代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的碳源,測GD-F2發(fā)酵液抑菌活性,結(jié)果見表2。

表2 不同碳源對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響Tab.2 Effect of different carbon sources on the antibiotic activity of GD-F2

由表2可知,4種碳源差異不大,均能有效合成抗生素。考慮到可溶性淀粉價廉易得,因此,選擇碳源為可溶性淀粉。

2.2.2 不同氮源對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響

分別以1%的大豆粉、酵母膏、蛋白胨和(NH4)2SO4代替基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的氮源,測GD-F2發(fā)酵液抑菌活性,結(jié)果見表3。

表3 不同氮源對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響Tab.3 Effect of different nitrogen sources on the antibiotic activity of GD-F2

由表3可知,以大豆粉、酵母膏作氮源效果較好,均能有效合成抗菌活性物質(zhì)。因此,選擇氮源為大豆粉或酵母膏。

2.2.3 鹽濃度對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響

以實驗室所取天然海水鹽濃度為標(biāo)準(zhǔn)(20℃時測定其密度為1.017 g·cm-3,設(shè)為1),考察鹽濃度對GD-F2產(chǎn)抗生素的影響,結(jié)果見圖1。

圖1 鹽濃度對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響Fig.1 Effect of salinity on the antibiotic activity of GD-F2

由圖1可知,當(dāng)培養(yǎng)基鹽濃度為天然海水的50%～100%時,抑菌圈直徑變化不明顯,表明GD-F2均能有效合成抗生素。因此,選用天然海水與蒸餾水各一半配制培養(yǎng)基。

2.2.4 無機鹽濃度對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響

將改良高氏一號培養(yǎng)基的無機鹽濃度設(shè)為1,考察無機鹽濃度對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 無機鹽濃度對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響Fig.2 Effect of inorganic salt concentration on the antibiotic activity of GD-F2

由圖2可知,當(dāng)無機鹽濃度為改良高氏一號培養(yǎng)基的50%～100%時,抑菌圈直徑變化不明顯。因此,選用50%的無機鹽濃度,即MgSO4·7 H2O 0.025%, K2HPO40.025%,KNO30.05%,FeSO4·7H2O 0.0005%。

2.2.5 p H值對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響

采用優(yōu)化碳源、氮源、天然海水與蒸餾水各一半配制配養(yǎng)基,用1 mol·L-1HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始p H值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,檢測GD-F2發(fā)酵6 d的抑菌圈直徑,結(jié)果見圖3。

由圖3可知,p H值＞8.0或p H值＜6.0時,抑菌圈直徑直線下降;培養(yǎng)基初始p H值接近中性時(p H值6.0～8.0)抑菌圈直徑較大。因此,配制培養(yǎng)基時選取p H值為7.0。

圖3 p H值對菌株GD-F2產(chǎn)抗生素的影響Fig.3 Effect of p H value on the antibiotic activity of GD-F2

3 結(jié)論

從32株南極海洋放線菌中,成功篩選出3株抗生素產(chǎn)生菌GD-F1、GD-F2、GD-F3,其中GD-F2抑菌活性較高,進一步確定GD-F2產(chǎn)抗生素的最佳培養(yǎng)條件為:碳源為可溶性淀粉、氮源為大豆粉或酵母膏、用天然海水和蒸餾水各一半配制培養(yǎng)基、無機鹽濃度為改良高氏一號培養(yǎng)基的一半、p H值為7.0,為南極海洋放線菌的機理研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

[1] 李勇,李銘剛.放線菌YIM31249發(fā)酵液萃取物的抗菌活性初步研究[J].化工時刊,2004,18(5):45-47.

[2] Watve M G,Tickoo R,Jog M M,et al.How many antibiotics are produced by the genus Streptomyces[J].Arch Microbiol,2001, 176(5):386-390.

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[4] 胡繼蘭,張春穎,娜仁,等.產(chǎn)生抗腫瘤抗生素Sandramycin的南極放線菌C3905[J].微生物學(xué)報,2000,40(6):646-649.

[5] 朱躍進,龍中兒,黃運紅,等.一株稀有放線菌發(fā)酵產(chǎn)抗生素的工藝研究[J].化學(xué)與生物工程,2006,23(12):39-42.

Screening and Optimization of Culture Conditions of Antarctic Marine Actinomycete Producing Antibiotics

PENG Bin,SUN Chao
(College of Chemical Engineering and Environment,Weifang University of Science and Technology,Shouguang 262700,China)

The antibiotic activity of 32 strains of antarctic marine Actinomycete were tested and 3 strains GD-F1,GD-F2,GD-F3 with antibiotic activity were screened,among which strain GD-F2 had the highest antibiotic activity.The culture conditions for strain GD-F2 were obtained as follows:with soluble starch as carbon source,with bean powder or yeast extract as nitrogen source,the medium with p H value of 7.0 was made with natural sea water-distilled water(1∶1),the concentrations of inorganic salts were half of those of improved Gao No.1 culture medium.This study will lay the foundation for adaptation mechanism research and biotechnological application of antarctic marine Actinomycete.

antarctic marine Actinomycete;antibiotics;separation and screening

Q 939

A

1672-5425(2013)03-0064-03

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.017

2012-12-14

彭彬(1986-),女,山東壽光人,講師,研究方向:生物工程,E-mail:kdsunchao@163.com。