介質(zhì)泄漏對循環(huán)冷卻水中微生物多樣性的影響

董文文,劉 芳,仲慧赟,盧憲輝,陸津津

(中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院,山東青島266580)

介質(zhì)泄漏對循環(huán)冷卻水中微生物多樣性的影響

董文文,劉 芳,仲慧赟,盧憲輝,陸津津

(中國石油大學(xué)(華東)化學(xué)工程學(xué)院,山東青島266580)

以循環(huán)冷卻水作為接種水對生物粘泥進(jìn)行培養(yǎng),向循環(huán)冷卻水中加入柴油以模擬煉油廠中的介質(zhì)泄漏現(xiàn)象,對介質(zhì)泄漏影響下生物粘泥中的微生物進(jìn)行微觀分析,利用掃描電子顯微鏡(SEM)觀察生物粘泥內(nèi)部的空間結(jié)構(gòu)、緊密度等,利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù),分析不同生物粘泥中的內(nèi)部優(yōu)勢菌種、微生物多樣性及相似性。SEM分析表明,與未投油的生物粘泥比較,投加0.3 g·L-1柴油時的生物粘泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜、緊密度好,而投加0.9 g·L-1柴油時的生物粘泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡單、緊密度差。PCR-DGGE分析表明,與投加0.9 g·L-1柴油的生物污泥相比,投加0.3 g·L-1柴油的生物粘泥的細(xì)菌數(shù)量和種類更多,微生物多樣性更大,優(yōu)勢菌種更多。

介質(zhì)泄漏;生物粘泥;SEM;PCR-DGGE;微生物多樣性

煉油企業(yè)生產(chǎn)中的循環(huán)冷卻水由于長期的不斷蒸發(fā)、循環(huán)利用,導(dǎo)致其中滋生微生物,對煉油企業(yè)的日常生產(chǎn)造成一定的影響[1]。而煉油企業(yè)中的冷卻設(shè)備也會因為設(shè)備腐蝕、管線老化、密封技術(shù)落后等原因出現(xiàn)介質(zhì)泄漏現(xiàn)象,泄漏的介質(zhì)為循環(huán)冷卻水中的微生物提供了大量的碳源,導(dǎo)致微生物大量滋生、生物粘泥大量堆積,引起垢下腐蝕、換熱效率低下等一系列問題。目前,有效控制生物粘泥的方法很多[2],但大多數(shù)煉油企業(yè)通過投加殺菌劑來加以控制。

武獻(xiàn)春等[3]曾對石家莊焦化集團有限責(zé)任公司煤氣凈化分廠介質(zhì)泄漏后的循環(huán)水進(jìn)行水質(zhì)分析,結(jié)果表明,循環(huán)水的濁度以及細(xì)菌量明顯增大,殺菌效率明顯降低。馬濤等[4]對不同營養(yǎng)水平下生物粘泥的優(yōu)勢菌種進(jìn)行了分析,結(jié)果表明,不同的營養(yǎng)水平下,生物粘泥中的優(yōu)勢菌種不同,而且細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差別較大。

目前,國內(nèi)外對殺菌劑的研究都是針對正常的循環(huán)冷卻水,而對于介質(zhì)泄漏影響下的殺菌劑尚無深入的研究。為此,作者采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù),對介質(zhì)泄漏影響下的生物粘泥進(jìn)行分析,考察不同泄漏條件下的優(yōu)勢菌種,擬為煉油企業(yè)選取有效的殺菌劑提供理論依據(jù)。

1 實驗

1.1 生物粘泥的培養(yǎng)

實驗裝置為RCC-Ⅱ型旋轉(zhuǎn)腐蝕掛片實驗儀,采用標(biāo)準(zhǔn)不銹鋼掛片(AISI304,50 mm×25 mm×2 mm)。采用定時排水濃縮法培養(yǎng)生物粘泥,控制水溫為(35±1)℃、p H值為7～8,加入一定量的培養(yǎng)液(葡萄糖作碳源、硫酸銨作氮源、磷酸氫二鈉作磷源,控制C∶N∶P為50∶10∶1),每隔12 h換水排掉懸浮態(tài)細(xì)菌,用自來水補充試液體積至刻度,以保證掛片表面的附著態(tài)細(xì)菌攝取充足養(yǎng)分,當(dāng)生物粘泥長到穩(wěn)定附著期時,向其中加入0 g·L-1、0.3 g·L-1、0.9 g· L-1的柴油,培養(yǎng)48 h。

1.2 掃描電子顯微鏡(SEM)分析

將附著粘泥的掛片放在燒杯中,用2.5%磷酸緩沖戊二醛固定液在4℃黑暗中固定24 h,然后依次用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇和100%乙醇脫水10 min后自然干燥,鍍金觀察。

1.3 基因組DNA提取和純化

1.3.1 生物粘泥樣品的處理

取1 m L生物污泥于5000 r·min-1離心10 min。用400μL STET緩沖溶液重懸沉淀,將40μL 50 mg·mL-1的溶菌酶加到懸液中,室溫放置5min,然后94℃放置1min;加入10%SDS至終濃度為0.5%、20mg·mL-1蛋白酶K至終濃度為100μg·mL-1,混合后37℃下放置保溫1h[5]。

1.3.2 基因組DNA的提取[6]

向處理后生物粘泥樣品中加入5mol·L-1NaCl溶液至終濃度為0.5mol·L-1,充分混勻,再加入0.1BV的5%CTAB-NaCl溶液,混合,于65℃下放置保溫10min;加入1BV的飽和酚,混勻,于13000r· min-1離心10min,將上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈的Eppendorf管中;加入1BV的酚-氯仿-異戊醇,混勻,于13000r·min-1離心10min,將水相轉(zhuǎn)入另一潔凈的Eppendorf管中;用1BV的氯仿抽提,于13000r· min-1離心10min,將上清液轉(zhuǎn)入另一潔凈的Eppendorf管中;加入0.1BV的2mol·L-1乙酸鈉和2BV的冷100%乙醇,混勻,-20℃下放置1h或過夜;于13000r·min-1離心10min,小心吸出或者倒出乙醇,用500μL70%冷乙醇洗滌沉淀,于13000r· min-1離心5min;小心吸出或者倒出乙醇,然后在吸水紙上倒置使殘余乙醇流盡,空氣干燥10～15min,以便表面乙醇揮發(fā),注意不要使沉淀完全干燥;以50μLTE緩沖溶液重懸DNA沉淀,用微量移液器吹吸,混合至DNA充分溶解;分裝后于-20℃存放(不可使用自動除霜冰箱,以避免DNA反復(fù)冷凍)。

1.4 PCR擴增及純化

1.4.1 目的片段的擴增及檢測

以V2-V3區(qū)設(shè)計通用引物BSF338F和BSF518R[7]。

在冰浴及無菌條件下進(jìn)行加樣操作。

PCR[8]擴增條件為:95℃預(yù)變性5min,94℃變性40s,56℃退火40s,72℃延伸40s,35個循環(huán), 72℃最終延伸10min,4℃保存。

1.4.2 PCR產(chǎn)物的純化

用華舜膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收目的片段并電泳檢測,若無雜帶則采用優(yōu)化的PCR純化方法純化。

1.5 DGGE凝膠電泳

(1)采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。

(2)使用梯度混合裝置,制備6%和8%的聚丙烯酰胺凝膠,變性劑濃度范圍40%～60%(100%的變性劑為7mol·L-1尿素-40%去離子甲酰胺),其中變性劑和聚丙烯酰胺的濃度從膠的上方向下方依次遞增。

(3)待變性梯度膠完全凝固后,將膠板放入裝有電泳緩沖溶液的電泳槽中,取6μLPCR樣品和6μL加樣緩沖溶液(6倍Loadingbuffer與去離子甲酰胺按1∶1混合)混合后加入上樣孔。

(4)用引物BSF338F/BSF518R擴增片段,在150V、60℃下電泳400min。電泳結(jié)束后,將凝膠進(jìn)行銀染。

(5)用UMAXPowerLook1000型透射掃描儀掃描染色后的凝膠獲取膠圖。在分析后的凝膠兩面覆上干膠膜(Promega),用干膠夾定型,自然干燥后長期保存。

1.6 DGGE中特異條帶的回收、克隆、測序及分析

將DGGE中特異條帶及代表性的條帶切下,回收條帶并按文獻(xiàn)方法回收單鏈DNA。以回收的DNA為模板,用相同的引物(不帶GC夾),按1.4方法進(jìn)行PCR擴增,準(zhǔn)備克隆測序。

1.7 連接與轉(zhuǎn)化

(1)在微量離心管(PCR管)中配制下列DNA溶液,總量為5μL:PMD19-T或PMD19-TVector 1μL,DNAsolution4μL;

(2)加入5μL(等量)的LigationMix;

(3)16℃連接9h;

(4)全量10μL加至100μL感受態(tài)細(xì)胞中,冰浴30min;

(5)42℃水浴105s后,再冰浴3min;

(6)加入890μLSOC培養(yǎng)基,于37℃、75r· min-1下培養(yǎng)60min;

(7)配制LB/Amp/IPTG/X-Gal固體培養(yǎng)基(大平板需要50mL培養(yǎng)基,小平板需要20mL培養(yǎng)基)。在1LLB固體培養(yǎng)基中加入1mLAmp、1mLIPTG和2mLX-Gal,用20μL培養(yǎng)液涂平板,37℃下倒置培養(yǎng)過夜,形成單菌落。記數(shù)白色、藍(lán)色菌落。

1.8 檢測

(1)向LB液體培養(yǎng)基中加入Amp,分裝到離心管中;

(2)用通用引物M13R和M13F作菌落PCR;

(3)挑取白色菌落至PCR管和離心管;

(4)離心管于37℃下培養(yǎng),PCR反應(yīng)陽性者測序。

1.9 PCR-DGGE譜圖分析

1.9.1 Shannon-Weiner指數(shù)

利用生態(tài)學(xué)的生物多樣性指數(shù)Shannon-Weiner指數(shù)H[9]對DGGE條帶所表示的微生物種群的多樣性進(jìn)行表征,H數(shù)值越大,表明未確定性越大,種群多樣性越高[10]。以Quantity One軟件對不同樣品DGGE圖譜進(jìn)行條帶掃描及識別,得出不同條帶的數(shù)目及其相應(yīng)的吸收峰值。將其條帶數(shù)目及各自的吸收峰面積等參數(shù)導(dǎo)入Excel,按以下公式計算不同樣品的H值:

式中:H為Shannon-Weiner指數(shù);s為每條泳帶中條帶總數(shù);ni為單一條帶i的峰面積;N為所有峰的總面積;pi為特定條帶亮度相對于所有條帶總亮度的比率。

1.9.2 豐富度指數(shù)

物種豐富度指數(shù)S為DGGE圖譜中優(yōu)勢條帶的總數(shù),可認(rèn)為DGGE圖譜中每個條帶都對應(yīng)著一種細(xì)菌。

1.9.3 均勻度指數(shù)

均勻度指數(shù)EH(又稱PieLou指數(shù))是測量群體中個體數(shù)在各物種上的分配狀況的指標(biāo),其大小表明群體中物種的均勻度關(guān)系。均勻度指數(shù)越高,表明各個物種分配得越均勻。其計算公式如下:

2 結(jié)果與討論

2.1 生物粘泥群落結(jié)構(gòu)分析

挑選生長至穩(wěn)定期的生物粘泥共3組:第1組為不投加柴油的自然生長的生物粘泥樣品、第2組為投加0.3 g·L-1柴油的生物粘泥樣品、第3組為投加0.9 g·L-1柴油的生物粘泥樣品,用S-4800型冷場掃描電鏡進(jìn)行掃描,觀察生物粘泥的微觀結(jié)構(gòu),如圖1所示。

圖1 生物粘泥放大900倍(a、b、c)和放大7000倍(a′、b′、c′)的SEM照片F(xiàn)ig.1 SEM Images of slime magnified by 900 folds(a,b,c)and 7000 folds(a′,b′,c′)

由圖1可知,不投油時,生物粘泥比較疏松,緊密度較差,呈現(xiàn)分散生長的狀態(tài);投油之后,生物粘泥粘滯性增強,結(jié)構(gòu)變成較大的塊狀,當(dāng)投油量為0.3 g· L-1時,生物粘泥塊狀結(jié)構(gòu)較大,粘結(jié)性較好、緊密度較好;而投油量為0.9 g·L-1時,生物粘泥分散為小塊,粘結(jié)性和緊密度很差。這是由于,柴油的加入為微生物提供了大量的碳源,促進(jìn)了微生物的生長,微生物在生長過程中會向外界分泌粘性物質(zhì),這些粘性物質(zhì)會將微生物以及水環(huán)境中的懸浮物質(zhì)聚集在一起,形成較大的塊狀結(jié)構(gòu)。同時,生物粘泥的胞外聚合物(EPS)中含有脂類、蛋白質(zhì)等疏水分子,可使污泥表面呈局部疏水性,還含有能與二價陽離子結(jié)合的陰離子基團,可以在顆粒間起到架橋作用,而EPS的含量在投油量為0.3 g·L-1時達(dá)到最大值,加之柴油的粘滯性,此時生物粘泥之間聚集成的塊狀結(jié)構(gòu)最大;隨著投油量增加至0.9 g·L-1時,生物粘泥中的EPS含量減少,架橋作用減弱,而柴油粘附在微生物表面上形成的油膜越來越厚,阻礙溶解氧的進(jìn)入,油層下的微生物就處于缺氧的狀態(tài),使微生物的生長受到抑制。

2.2 PCR-DGGE分析

選取柴油投加量為0.3 g·L-1和0.9 g·L-1時的生物粘泥樣品進(jìn)行PCR-DGGE分析。

將生物粘泥樣品提取到的DNA的TE溶液進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖2所示。

圖2 生物粘泥樣品基因組DNA的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Genome DNA agarose gel electrophorogram of slime samples

由圖2可知,樣品總基因組片段的亮度和純度都較好,沒有出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象,說明DNA的提取效果良好。

將生物粘泥樣品的16S rDNA片段的PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果如圖3所示。

圖3 生物粘泥樣品PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 PCR Amplification product agarose gel electrophorogram of slime samples

由圖3可知,生物粘泥樣品的16S r DNA片段PCR擴增條帶亮度和純度都比較好,未出現(xiàn)非特異性擴增。通過與DNA Marker(DI2000)對比,得到其片段大小約為200 bp,且陰性對照未有產(chǎn)物出現(xiàn),說明PCR擴增效果良好,可進(jìn)行DGGE分析。

測試生物粘泥樣品的16S rDNA片段擴增產(chǎn)物的DGGE分離譜圖,利用Quantity One(v4.62,Bio-Rad)軟件掃描2條泳道,選取適當(dāng)?shù)臈l帶檢測靈敏度、條帶邊界靈敏度、降噪度等參數(shù)后得到條帶分布模式,并得出對應(yīng)的量化后各個條帶的峰密度值,結(jié)果如圖4所示。

圖4 生物粘泥樣品的PCR產(chǎn)物的DGGE分離譜圖(a)及其對應(yīng)的分布模式(b)和量化后的峰密度值分布(c)Fig.4 DGGE Separation pattern(a)and the corresponding distribution mode(b)and peak density value distribution after quantification(c)of PCR product

2.3 介質(zhì)泄漏影響下生物粘泥細(xì)菌群落多樣性分析

根據(jù)電泳圖譜中每個條帶的強度,計算生物粘泥樣品的細(xì)菌Shannon-Weiner指數(shù)(H)、豐富度指數(shù)(S)和均勻度指數(shù)(EH),結(jié)果如表1所示。

表1 生物粘泥樣品的Shannon-Weiner指數(shù)、豐富度指數(shù)及均勻度指數(shù)Tab.1 Shannon-Weiner index,richness index and evenness index of slime samples

由表1可知,投油量為0.3 g·L-1時生物粘泥樣品的Shannon-Weiner指數(shù)、豐富度指數(shù)及均勻度指數(shù)均大于投油量為0.9 g·L-1時。這說明投油量為0.3 g·L-1時生物粘泥中的細(xì)菌種類更多、分布也更均勻。

環(huán)境條件的差異會引起細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,在同一系統(tǒng)中,附著態(tài)與懸浮態(tài)細(xì)菌的優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)也可能不盡相同。本實驗過程中,水溫、p H值、水力剪切力等條件始終保持一致,因此可以認(rèn)為柴油的投加量是導(dǎo)致生物粘泥中細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)與多樣性變化的決定性因素。由于柴油的投加量會影響水體中營養(yǎng)碳源的含量、溶解氧的濃度和水質(zhì),而不同種類微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的親和力與競爭能力、對氧氣的需求和對水體環(huán)境變化的適應(yīng)性存在差別,因此不同的投油量會引起細(xì)菌數(shù)量及EPS濃度[11]的變化,進(jìn)而改變生物粘泥的空間結(jié)構(gòu),粘泥內(nèi)部會出現(xiàn)不同程度的缺氧或厭氧層,部分細(xì)菌的生長繁殖受其周圍微環(huán)境的影響而此消彼長,導(dǎo)致生物粘泥的優(yōu)勢菌種組成及多樣性產(chǎn)生差異[12]。

2.4 介質(zhì)泄漏影響下生物粘泥中優(yōu)勢菌種的鑒定

選取圖4中14個條帶進(jìn)行切膠測序,并應(yīng)用GenBank的BLAST程序?qū)y得的DNA序列與Gen-Bank數(shù)據(jù)庫中已登錄的序列進(jìn)行同源性檢索和比對,以確定目標(biāo)菌種的歸屬,結(jié)果如表2所示。

表2 DGGE譜圖優(yōu)勢條帶基因片段序列比對結(jié)果Tab.2 Advantage stripe gene fragment sequence comparison results of DGGE

由表2可知,實驗所測各個條帶與其對應(yīng)的Gen-Bank中最相近的菌種的DNA序列同源性均在94%以上[13],其中條帶1、3、4、6、8分別與Uncultured Pedomicrobium sp.、Arthrobacter sp.4-83(2012)、Microbacterium sp.enrichment culture clone WW1_3-78、Stenotrophomonas sp.AR36、Rhodanobacter sp. IMER-B2-16的同源性甚至達(dá)到100%。由表2還可知,鑒定出的菌種中有3種是不可培養(yǎng)細(xì)菌(Uncultured bacterium),可見,PCR-DGGE技術(shù)的運用能夠有效避免傳統(tǒng)分離培養(yǎng)使用的培養(yǎng)基營養(yǎng)結(jié)構(gòu)單一、無法滿足環(huán)境樣品中微生物需求的局限性,從而提高了鑒定結(jié)果的完整性和準(zhǔn)確性。

依據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊[14]對每個條帶所代表的優(yōu)勢菌種進(jìn)行科屬鑒定,結(jié)果如表3所示。

表3 DGGE譜圖中不同條帶代表的生物粘泥中的優(yōu)勢菌種鑒定結(jié)果Tab.3 The identification of the dominant species in slime represented by different stripes of DGGE

綜合分析圖4、表2、表3結(jié)果可知,不同投油量水平下,生物粘泥中的優(yōu)勢菌種存在較大差別。例如,在投油量為0.3 g·L-1的生物粘泥中,柴油作為生物粘泥營養(yǎng)碳源的促進(jìn)作用占優(yōu)勢,水體中的氧含量也降低不大,假單胞菌屬細(xì)菌是嚴(yán)格需氧的革蘭氏染色陰性無芽孢桿菌,這類細(xì)菌的生長溫度范圍廣,對營養(yǎng)要求不高,因此可成為生物粘泥中的優(yōu)勢菌種。而在投油量為0.9 g·L-1時,柴油阻止空氣進(jìn)入水體的抑制作用造成粘泥內(nèi)部出現(xiàn)不同程度的缺氧甚至厭氧區(qū)域,限制了假單胞菌屬的生長繁殖[15],因此在投油量為0.9 g·L-1的循環(huán)冷卻水中,假單胞菌屬細(xì)菌無法成為生物粘泥中優(yōu)勢菌種。

3 結(jié)論

以循環(huán)冷卻水作為接種水對生物粘泥進(jìn)行培養(yǎng),向循環(huán)冷卻水中加入柴油以模擬煉油廠中的介質(zhì)泄漏現(xiàn)象,對介質(zhì)泄漏影響下生物粘泥中的微生物進(jìn)行微觀分析。SEM分析表明,與未投油的生物粘泥比較,投加0.3 g·L-1柴油時的生物粘泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)復(fù)雜、緊密度好,而投加0.9 g·L-1柴油時的生物粘泥內(nèi)部結(jié)構(gòu)簡單、緊密度差。PCR-DGGE分析表明,與投加0.9 g·L-1柴油的生物污泥相比,投加0.3 g·L-1的生物粘泥的細(xì)菌數(shù)量和種類更多,微生物多樣性更大,優(yōu)勢菌種更多。

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The Effect of Medium Leakage on the Microbial Diversity of Circulating Cooling Water

DONG Wen-wen,LIU Fang,ZHONG Hui-yun,LU Xian-hui,LU Jin-jin
(College of Chemical Engineering,China University of Petroleum,Qingdao 266580,China)

The slime was cultured with the circulating cooling water as the inoculated water,adding diesel to analog medium leakage of refineries.Microorganisms in the slime under the influence of medium leakage were analyzed,and the structure,density,thickness and compactness inside the slime were observed with scanning electron microscope(SEM).The dominant species,microbial diversity and similarity of different slimes were analyzed by using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE).The SEM results showed that campared with the slime without adding diesel,the slime adding 0.3 g·L-1of diesel had complex structure and higher compactness,but the slime adding 0.9 g·L-1of diesel had simple structure and lower compactness.The PCR-DGGE result showed that,quantity and types of bacteria,the microbial diversity and the dominant species amount of the slime adding 0.3 g·L-1of diesel were all superior to those of that adding 0.9 g·L-1of diesel.

medium leakage;slime;SEM;PCR-DGGE;microbial diversity

Q 938.15

A

1672-5425(2013)03-0021-06

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.006

國家自然科學(xué)基金資助項目(21077133),中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金資助項目(11CX06045A)

2012-12-06

董文文(1987-),女,山東人,碩士研究生,研究方向:水污染控制與資源化利用,E-mail:wenchang13@126.com;通訊作者:劉芳,副教授,E-mail:liufangfw@163.com。