鈷(Ⅱ)對(duì)纖維蛋白原硝化損傷及活性的影響研究

丁 楊,羅云敬,史建龍,徐世奎

(北京工業(yè)大學(xué),北京100124)

鈷(Ⅱ)對(duì)纖維蛋白原硝化損傷及活性的影響研究

丁 楊,羅云敬,史建龍,徐世奎

(北京工業(yè)大學(xué),北京100124)

以纖維蛋白原為研究對(duì)象,運(yùn)用紫外分光光度法、三維熒光光譜法、SDS-PAGE和Von-Clauss法研究了Co (Ⅱ)參與過(guò)氧亞硝酸根(ONOO-)介導(dǎo)的纖維蛋白原硝化反應(yīng)過(guò)程。結(jié)果表明,Co(Ⅱ)對(duì)ONOO-硝化損傷纖維蛋白原存在明顯的促進(jìn)作用,并加劇了硝化損傷后纖維蛋白原凝聚活性的下降。

過(guò)氧亞硝酸根;纖維蛋白原;Von-Clauss法;鈷(Ⅱ)

纖維蛋白原(Fibrinogen,Fg)是一種可溶于水的糖蛋白,每個(gè)纖維蛋白原分子由3對(duì)非等同的多肽鏈Aα、Bβ和γ構(gòu)成[1,2],易被氧化硝化,它的損傷可導(dǎo)致體內(nèi)的血粘度升高,血小板聚集性增強(qiáng),冠狀動(dòng)脈血栓發(fā)生率增加,促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[3-5]。過(guò)氧亞硝酸根離子(ONOO-)具有很強(qiáng)的硝化和氧化能力,可以在生理或病理?xiàng)l件下,對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯后修飾[6]。這種修飾可造成蛋白質(zhì)的硝化進(jìn)而導(dǎo)致變性,產(chǎn)生一系列的細(xì)胞毒性作用,最終可能引發(fā)疾病,如心血管疾病、帕金森癥等等[7,8]。鈷是生物體內(nèi)存在的重要且必需的微量金屬元素,能刺激人體骨髓的造血系統(tǒng),并與心血管疾病有著一定的聯(lián)系。有報(bào)道表明鈷可以催化芳香類化合物的硝化[9,10]。鑒于鈷元素的重要生物功能,作者對(duì)Co(Ⅱ)參與的ONOO-硝化損傷纖維蛋白原殘基過(guò)程進(jìn)行了研究并對(duì)硝化損傷后纖維蛋白原的生物活性進(jìn)行了評(píng)價(jià),對(duì)于揭示ONOO-的生理作用機(jī)制,了解相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理并進(jìn)行預(yù)防和治療有著重要意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

纖維蛋白原、凝血酶,美國(guó)Sigma公司。ONOO-溶液按照1995年Uppu等[11]提出的兩相反應(yīng)體系過(guò)氧化氫與亞硝酸異戊酯的取代反應(yīng)制備。每次實(shí)驗(yàn)前用紫外可見分光光度計(jì)在302 nm處測(cè)定ONOO-的吸光度,根據(jù)ε302=1670 L·mol-1·cm-1計(jì)算ONOO-濃度。實(shí)驗(yàn)用水為二次去離子水,其它常用試劑均為分析純或電泳級(jí)。

U3010型紫外可見分光光度計(jì)、F4500型熒光分光光度計(jì),日本日立公司;DYY-12C型電泳儀,北京六一儀器廠。

1.2方法

1.2.1 紫外分光光度法

將纖維蛋白原溶于0.1 mol·L-1的PBS緩沖溶液(p H值7.4)中,37℃下孵育5 min。將ONOO-以0.018 mmol·L-1·min-1的恒定速率(ONOO-終濃度為0.53 mmol·L-1)注入到不斷攪拌的纖維蛋白原溶液(1 mg·m L-1,37℃)中反應(yīng)30 min。在反應(yīng)體系中分別加入0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL濃度為10 mmol·L-1的CoCl2溶液[即反應(yīng)體系中CoCl2終濃度(mmol·L-1)分別為0、0.017、0.03、0.05、0.067、0.083],反應(yīng)前后體系p H值變化不超過(guò)0.1個(gè)p H單位。隨后測(cè)定反應(yīng)體系在360 nm處的紫外吸光度值(纖維蛋白原修飾產(chǎn)物3-NTyr在360 nm處有最大吸收ε=4400 L·mol-1· cm-1)。

1.2.2 三維熒光光譜法

在比色管中加入纖維蛋白原溶液,再分別加入0μL、5μL、10μL、15μL和20μL濃度為10 mmol· L-1的CoCl2溶液[即反應(yīng)體系中CoCl2終濃度(mmol ·L-1)分別為0、0.017、0.03、0.05、0.067]。隨后以0.018 mmol·L-1·min-1的速率向比色管中加入ONOO-至終濃度為0.53 mmol·L-1,恒溫37℃下反應(yīng)30 min。反應(yīng)結(jié)束靜置10 min后進(jìn)行三維熒光分析。

1.2.3 SDS-PAGE電泳

將纖維蛋白原溶于0.1 mol·L-1的PBS緩沖溶液(p H值7.4)中,加入0μL、5μL、10μL、15μL、25μL和30μL 10 mmol·L-1的CoCl2溶液[即反應(yīng)體系中CoCl2終濃度(mmol·L-1)分別為0、0.017、0.03、0.05、0.083、0.1],與ONOO-反應(yīng)5 min,測(cè)硝化纖維蛋白原的電泳圖。采用12%的分離膠和5%的濃縮膠,上樣后,設(shè)置起始電壓為100 V,待指示前沿到達(dá)分離膠后調(diào)節(jié)電壓為120 V。當(dāng)前沿指示距底端約1 cm時(shí),切斷電壓。染色1 h,脫色至背景色完全消失。

1.2.4 Von-Clauss法

將凝血酶均勻溶于0.05 mol·L-1的CaCl2溶液中,使其活力為100 U·m L-1;37℃水箱孵育5 min后,以1∶1(體積比)的比例向纖維蛋白原的反應(yīng)溶液中加入凝血酶,用Von-Clauss法檢測(cè)其凝聚時(shí)間。具體如下:在加入凝血酶后,用帶鉤的小棒以每分鐘1次的固定速度上下鉤動(dòng)溶液,當(dāng)出現(xiàn)明顯纖維絲和凝聚塊時(shí),記錄時(shí)間,每個(gè)樣品進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 紫外分光光度法檢測(cè)Co(Ⅱ)對(duì)纖維蛋白原硝化損傷的作用(圖1)

由圖1可知,隨著反應(yīng)體系中CoCl2濃度由0逐漸增大到0.083 mmol·L-1,3-NTyr的生成量也不斷增多,體系在360 nm處的紫外吸光度值由最初的1.067逐漸增大到1.764,增幅65.3%。表明Co(Ⅱ)促進(jìn)了3-Ntyr的生成,即Co(Ⅱ)在ONOO-硝化損傷纖維蛋白原的反應(yīng)中起到了正向的促進(jìn)作用。

2.2 三維熒光法檢測(cè)Co(Ⅱ)對(duì)纖維蛋白原硝化損傷的作用(圖2)

圖2 Co(Ⅱ)存在下ONOO-損傷纖維蛋白原的三維熒光光譜Fig.2 3D-Fluorescence spectra of fibrinogen treated by ONOO-in the presence of Co(Ⅱ)

蛋白質(zhì)受激發(fā)能夠產(chǎn)生熒光,其熒光值不僅決定于蛋白質(zhì)本身,也與蛋白質(zhì)所處微環(huán)境相關(guān),二者的變化都能引起蛋白質(zhì)熒光值的變化。由圖2可知,1 mg ·m L-1的纖維蛋白原未硝化原液在Ex=280 nm、Em=340 nm左右有較強(qiáng)的熒光峰,峰值為1035,在Ex= 270 nm、Em=320 nm左右有一較弱的熒光峰,峰值為762。初步判斷這兩個(gè)峰分別為色氨酸和酪氨酸。隨著反應(yīng)體系中Co(Ⅱ)濃度的逐漸增大,兩個(gè)熒光峰峰值呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢(shì),當(dāng)Co(Ⅱ)的濃度為0.067 mmol·L-1時(shí),其熒光峰峰值為642和423,較纖維蛋白原原液分別下降了37.9%和44.5%。硝化損傷后纖維蛋白原熒光值的下降,是因?yàn)榧尤隣NOO-后,使纖維蛋白原產(chǎn)生修飾產(chǎn)物3-NTyr、色氨酸發(fā)生硝化,改變了蛋白質(zhì)所處的微環(huán)境,使得纖維蛋白原的熒光發(fā)生猝滅,熒光強(qiáng)度下降。在反應(yīng)體系中加入Co (Ⅱ)并增大其濃度,促進(jìn)了3-NTyr的生成并進(jìn)一步改變纖維蛋白原所處微環(huán)境,使其熒光值持續(xù)下降。進(jìn)一步驗(yàn)證了Co(Ⅱ)對(duì)于ONOO-硝化損傷纖維蛋白原起到促進(jìn)作用,Co(Ⅱ)濃度越大,促進(jìn)作用越明顯,兩者之間呈正相關(guān)。

2.3 SDS-PAGE檢測(cè)Co(Ⅱ)對(duì)纖維蛋白原硝化損傷的作用(圖3)

圖3 Co(Ⅱ)存在下ONOO-損傷纖維蛋白原的SDS-PAGE圖譜Fig.3 SDS-PAGE Electrophorogram of fibrinogen treated by ONOO-in the presence of Co(Ⅱ)

由圖3可知,纖維蛋白原在電泳圖上均出現(xiàn)了3條明顯的條帶,至上而下分別為纖維蛋白原Aα(66 k Da)、Bβ(52 k Da)和γ(46 k Da),相對(duì)于纖維蛋白原的原液來(lái)說(shuō),隨著Co(Ⅱ)濃度的增大,肽鏈損傷明顯,其中γ鏈最先變淺。表明Co(Ⅱ)的加入,加重了ONOO-對(duì)纖維蛋白原氨基酸的硝化損傷,使纖維蛋白原結(jié)構(gòu)中γ鏈?zhǔn)紫仁軗p,α鏈次之受損。

2.4 Co(Ⅱ)對(duì)ONOO-損傷纖維蛋白原凝聚活性的影響

在反應(yīng)體系中分別加入0μL、5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、30μL的10 mmol·L-1CoCl2溶液,硝化后用Von-Clauss法檢測(cè)纖維蛋白原凝聚活性,結(jié)果見圖4。

圖4 Co(Ⅱ)存在下ONOO-對(duì)纖維蛋白原凝聚活性的影響Fig.4 The clotting activity of fibrinogen treated by ONOO-in the presence of Co(Ⅱ)

由圖4可知,纖維蛋白原凝集成絲的時(shí)間分別為9 s、11 s、13 s、15 s、17 s、20 s、22 s,成絲后再凝集成塊的時(shí)間分別12 s、17 s、20 s、22 s、25 s、27 s、29 s。在硝化相同時(shí)間下,纖維蛋白原的凝聚活性隨著Co(Ⅱ)添加量的增加而不斷降低,當(dāng)加入45μL時(shí),能看到少許的細(xì)絲,但無(wú)法在凝血酶的作用下形成凝膠,失去了凝聚活性,而對(duì)照實(shí)驗(yàn)中Co(Ⅱ)本身并不能與纖維蛋白原發(fā)生作用。這表明,Co(Ⅱ)在ONOO-損傷纖維蛋白原的過(guò)程中表現(xiàn)出了促進(jìn)作用,并且纖維蛋白原的凝聚活性與Co(Ⅱ)的添加量呈負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論

選用人體正常濃度范圍內(nèi)的Co(Ⅱ),較好地模擬了Co(Ⅱ)存在于體內(nèi)時(shí)ONOO-損傷纖維蛋白原的情況。Co(Ⅱ)對(duì)纖維蛋白原的硝化損傷有催化作用,促進(jìn)纖維蛋白原產(chǎn)生修飾產(chǎn)物3-NTyr,Co(Ⅱ)濃度與硝化損傷程度呈正相關(guān);在Co(Ⅱ)的促進(jìn)作用下, ONOO-首先損傷纖維蛋白原的γ鏈;隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng),纖維蛋白原的凝聚活性逐漸降低,并且在Co (Ⅱ)添加量達(dá)到一定程度時(shí)完全失去了凝聚能力。

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Study on Influence of Co(Ⅱ)on Nitration Damage of Fibrinogen and Its Activity

DING Yang,LUO Yun-jing,SHI Jian-long,XU Shi-kui
(Beijing University of Technology,Beijing 100124,China)

Taking fibrinogen as the object,its nitration reaction process via ONOO-in the presence of Co (Ⅱ)was investigated through ultraviolet spectrometry,3D-fluorescence spectrum,SDS-PAGE and Von-Clauss method.The results showed that Co(Ⅱ)promoted remarkably the fibrinogen nitration damage by ONOO-, and enhanced the clotting activity decrease of the fibrinogen damaged.

peroxynitrite(ONOO-);fibrinogen;Von-Clauss method;Co(Ⅱ)

O 611.62 Q 51

A

1672-5425(2013)03-0017-04

10.3969/j.issn.1672-5425.2013.03.005

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20875006),北京市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2102005),北京市教委科技面上項(xiàng)目(KM201210005032)

2013-01-10

丁楊(1987-),男,湖北襄陽(yáng)人,碩士研究生,研究方向:生物化學(xué)與分子生物學(xué);通訊作者:羅云敬,教授,E-mail:luoyj@ bjut.edu.cn。