N-mPEG-O-季銨化殼聚糖微球的制備及其載藥性能

王 軍，李明春，辛梅華，張曉林，毛揚帆

（華僑大學材料科學與工程學院，環(huán)境友好功能材料教育部工程研究中心，福建 廈門 361021）

殼聚糖具有良好的生物降解性、生物相容性和低毒等優(yōu)點，因此改性殼聚糖衍生物作為藥物載體成為研究的熱點。Wan等[1]合成了O-季銨化殼聚糖并以三聚磷酸鈉（TPP）為交聯(lián)劑制備納米微粒，研究其對牛血清蛋白的載藥結果表明O-季銨化殼聚糖納米粒比殼聚糖納米粒突釋小。Zhang等[2]以TPP交聯(lián)制備CS-mPEG納米粒，對胰島素的載藥結果表明微粒具有殼聚糖的核心和聚乙二醇（PEG）的外殼；PEG取代度增加載藥率增加，并且 PEG的引入使CS-mPEG微粒的釋放率增大并具有緩釋效果。Qu等[3]制備了N-mPEG-N-辛基-O-磺化殼聚糖載紫杉醇膠束，體內外評價結果表明PEG基團的引入使膠束在靜脈注射時更穩(wěn)定，具有緩釋效果。Liang等[4]合成PEG接枝季銨鹽殼聚糖并和膽固醇制備脂質體，對紫杉醇的載藥研究表明其對紫杉醇具有較好的包封率和載藥量，載藥脂質體在PBS7.4的緩沖溶液中有較好的緩釋效果，兩周后累積釋放率為80%～86%。綜上可見，季銨化改性殼聚糖具有減小突釋和弱堿性介質中緩釋的性能，而mPEG改性殼聚糖能提高載藥率、使藥物具有緩釋效果等功能，將兩者結合在一起有望制備載藥性能更優(yōu)的殼聚糖衍生物。

載藥微球具有延長藥物在體內的半衰期、保護藥物和控制藥物釋放等特點。Guerrero等[5]制備戊二醛交聯(lián)殼聚糖微球，對酮替芬的載藥量為 92 μg/mg，在 pH 值 7.4下能緩釋 50～100 h。Shavi等[6]制備交聯(lián)殼聚糖微球，對阿納托唑的載藥結果表明其具有緩釋效果，48 h后小鼠血藥濃度依然可檢測。但是目前報道的載藥殼聚糖微球，大多以TPP和戊二醛為交聯(lián)劑存在著微球穩(wěn)定性和細胞毒性等問題[7]。本文以反應條件溫和、反應效率高的水溶性二乙烯基砜為交聯(lián)劑[8]制備N-mPEG -O-季銨化殼聚糖微球（合成路線見圖 1），以酮洛芬為模型藥物研究引入mPEG和季銨鹽基團對改性殼聚糖微球載藥和釋放行為的影響，為PEG進一步改性的季銨化殼聚糖微球在藥物緩控釋中的應用提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器和試劑

FD-1B-50冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器公司）；UV-3100PC紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）； NEXUSU 470型傅里葉變換紅外光譜儀（美國Nicolet公司）；AvanceⅡ型核磁共振分析儀（瑞士Bruker公司）；VARIO EL Ⅲ元素分析儀（德國 Elementa 公司）；S-4800型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司）。

殼聚糖（CS，DD%=92.85%，=3×105）浙江金殼生物化學有限公司；聚乙二醇單甲醚（mPEG，=1000），上海晶純實業(yè)有限公司；3-氯-2-羥丙基三甲基氯化銨（CTA），實驗室自制[9]；二甲基亞砜（DMSO），上海國藥集團化學試劑公司；二乙烯基砜（DVS），上海海曲化工有限公司；酮洛芬（KP），武穴市迅達藥業(yè)；其它試劑均為市售分析純。

1.2 mPEG-CHO的合成

[10]并作適當?shù)男薷?，具體如下：將4g mPEG溶解于9 mL DMSO/CHCl3（體積比5/1）混合溶液中，在N2保護下滴入10 mL DMSO/乙酸酐（體積比4/1）混合液, 室溫反應10h。冰乙醚中沉淀，抽濾，產物用少量CHCl3溶解后再用冰乙醚沉淀，反復3次抽濾得醛化的mPEG。30℃真空干燥得mPEG-CHO。

1.3 N-mPEG-O-季銨化殼聚糖的合成

按照文獻[9]制備O-2-羥丙基三甲基氯化銨殼聚糖（QACS），然后將2 g QACS分散于50%甲醇/水溶液中, 加入mPEG-CHO的甲醇溶液，室溫反應4 h，NaBH4還原。產物用蒸餾水透析3天，冷凍干燥得QACS-mPEG。

1.4 N-mPEG-O-季銨化殼聚糖微球的制備

參考文獻[11]制備 DVS交聯(lián)微球，將 2 g QACS-mPEG溶于水后，倒入液體石蠟中，加入Span80 乳化30 min，滴入 0.97%的DVS-NaOH溶液，常溫反應2 h后升溫至40 ℃反應2 h。離心，取下層沉淀分別用石油醚、乙醇和水洗滌，40 ℃真空干燥得二乙烯基砜交聯(lián)QACS-mPEG微球。

CS和QACS分別溶于2%HAc和水中，按照上述步驟制備CS和QACS微球。

圖1 N-mPEG-O-季銨化殼聚糖的合成路線

1.5 產物的載藥性能

1.5.1 QACS-mPEG微球的載藥性能

取 50 mg QACS-mPEG微球加入 10 mL 60 mg/mL酮洛芬-乙醇溶液中，30 ℃恒溫水浴振蕩1 h（120 r/min），過濾，測定濾液在UV260 nm處的吸光值，由線性方程計算微球對酮洛芬的載藥量Qe如下：

式中V和W分別為溶液的體積（mL）和微球的質量（mg）；C0和C1分別表示酮洛芬的初始濃度和載藥后溶液中剩余酮洛芬的濃度（mg/mL）；Qe為載藥量（mg/mg）。

同樣方法測定CS和QACS交聯(lián)微球的Qe值。

1.5.2 載藥QACS-mPEG微球的藥物釋放行為

將上述載藥微球過濾，40 ℃真空干燥。分別取50 mg載藥QACS-mPEG微球加入裝有30 mL模擬腸液和模擬胃液[9]的錐形瓶中，37 ℃恒溫水浴振蕩（120 r/min）。每隔一定時間取5 mL釋放液并補充5 mL相應的釋放介質，在UV260 nm測定吸光值，由相應的標準曲線計算釋放液中酮洛芬的濃度并繪制釋放曲線。

同樣方法測定CS和QACS微球的釋放曲線。

2 結果與討論

2.1 產物的結構與表征

2.1.1 產物的紅外光譜分析

采用KBr 壓片法，測得N-mPEG-O-QACS微球制備過程中各產物的紅外光譜如圖2所示。

圖2 合成產物的FTIR圖

圖2中a、b分別為mPEG和mPEG-CHO的FTIR譜圖，2868 cm－1附近的吸收峰為聚乙二醇重復單元（—CH2—CH2—O—）中C—H的伸縮振動峰，1100 cm?1處為mPEG-CHO中醚鍵C—O—C的伸縮振動峰，b與a相比，1725 cm?1處出現(xiàn)了醛基的C=O伸縮振動吸收峰，證明mPEG已醛化[10]。c和d分別為CS和QACS的FTIR譜圖，d與c相比較，在1484 cm?1出現(xiàn)季銨鹽中甲基、亞甲基的C—H彎曲振動峰，1631 cm?1處出現(xiàn)季銨鹽的反對稱伸縮振動峰，991 cm?1處為季銨鹽的吸收峰，證明在分子中季銨鹽側鏈的引入[9]。e為QACS-mPEG的FTIR譜圖，與d相比較，1106 cm?1附近為mPEG的C—O—C伸縮振動吸收峰，1579 cm?1處—NH2吸收峰的減弱說明mPEG 被引入QACS的氨基上[10]。譜線f為二乙烯基砜交聯(lián)的QACS-mPEG微球的FTIR譜圖，與e相比，f 在1318 cm?1處為二乙烯砜中—SO2—的反對稱伸縮振動峰，說明產物為DVS交聯(lián)的QACS-mPEG。

2.1.2 產物的核磁共振分析

以D2O為溶劑，測得產物的1H NMR譜圖如圖3所示。其中δ4.76處是D2O的溶劑峰，δ3.41～3.44是—CH2（7）CH（8）（OH）CH2（9）N+(CH3)3（10）中H7、H8、H9位的質子峰，δ3.14是—N+(CH3)3（10）中H10的質子峰，說明季銨基團已被引入到殼聚糖的C6—OH上[12]。δ3.3是—NHCH2(e)CH2(d)中H(d)的質子峰，δ3.46～3.56是—OCH2CH2(c)和殼聚糖糖環(huán)殘基上H3、H4、H5、H6位的質子峰，δ3.71是—CH2CH2(b)OCH3中H(b)的質子峰，δ3.16是—OCH3(a)中H(a)的質子峰，δ2.97是殼聚糖糖環(huán)殘基上H2的質子峰，δ2.51是—NHCH2(e) CH2(d)—中H(e)的質子峰，δ1.97是殼聚糖中乙酰氨基（—NHCOCH3)中N上H的質子峰[10]。由FTIR和1H NMR說明產物為mPEG接枝季銨化殼聚糖衍生物。

2.1.3 產物的元素分析及取代度

N-mPEG-O-季銨化殼聚糖合成過程中各產物的元素分析結果見表1，表中CS（BA）和QACS（BA）分別為N-苯甲基殼聚糖和O-季銨化-N-苯甲基殼聚糖。用C/N計算各產物的取代度[12]，可見QACS、QACS-mPEG的取代度分別為59.20%和17.27%。

表1 合成產物的元素分析及取代度

圖3 合成產物的1H NMR譜圖

2.1.4 產物的溶解性試驗

分別稱取0.1 g樣品于100 mL溶劑中，觀察其溶解情況，結果見表2。

表2 產物的溶解性

由表2可以看出，CS只有在弱酸性條件下可以溶解，這是由于殼聚糖分子內和分子間的氫鍵作用。引入季銨基團后產物的水溶性明顯變好，O-季銨化殼聚糖（QACS）可以溶解在水和弱酸性溶液中，而N-mPEG接枝O-季銨化殼聚糖可以溶解在水、弱酸和弱堿性介質中，拓寬了應用范圍。

2.1.5 QACS-mPEG微球的SEM分析

用SEM觀察微球的外觀形貌，結果見圖4，可見乙烯基砜交聯(lián)QACS-mPEG微球球形較為完整，微球粒徑范圍在1～5 μm。

2.2 微球的載藥性能

稱取 60 ℃真空干燥至恒重的酮洛芬10 mg，乙醇溶解后轉入100 mL容量瓶定容得濃度為0.1 mg/mL的酮洛芬-乙醇溶液，稀釋得一系列濃度的標準溶液，在260 nm處測定吸光值，求得線性回歸方程為A=0.0693C+0.0034（R2=0.9998），C為μg/mL，線性范圍在0～30 μg/mL。

圖4 QACS-mPEG微球的SEM圖

分別稱取CS、QACS和QACS-mPEG微球各50 mg，置于10 mL 60 mg/mL的酮洛芬-乙醇溶液中，30 ℃恒溫水浴振蕩1 h（120 r/min），過濾，測定濾液在UV260 nm處的吸光值，由酮洛芬-乙醇溶液的線性方程，計算各微球的載藥量如表3所示。

由表3可見，在載藥條件相同的情況下QACS微球的載藥量優(yōu)于CS微球，這是因為季銨化殼聚糖的—N+(CH3)3基團具有較高的正電性，與含有負電性基團的酮洛芬之間的靜電締合作用增強，載藥量增加。而QACS-mPEG微球中除了季銨化殼聚糖和酮洛芬之間的靜電締合作用外，聚乙二醇基團與酮洛芬的氫鍵作用使載藥量進一步提高[13]。

表3 微球的載藥性能比較

2.3 載藥微球的藥物釋放性能

按照上述同樣方法配置一系列濃度的酮洛芬-模擬胃液和酮洛芬-模擬腸液溶液，在260 nm處測定吸光值，求得線性回歸方程分別為A=0.0611C+0.0101（R2=0.9998）和A=0.0681C－0.007（R2=0.9999），C為μg/mL，線性范圍0～30 μg/mL。

根據(jù)實驗部分1.5.3節(jié)的操作，測得載藥CS、QACS和QACS-mPEG微球在模擬胃液和腸液中的藥物釋放曲線如圖5。

從圖5中可以看出，CS微球在胃液和腸液中6～7 h藥物的釋放率達到90%以上。與CS微球不同，QACS微球在腸液中的釋放較為緩慢，35 h后累積釋放率為57%；而在胃液中，前7 h釋放較快，35 h后釋放平衡，累積釋放為75.6 %。這可能是因為季銨鹽基團和酮洛芬在不同pH值下存在形式不同，酮洛芬是一種酸性藥物，在pH=7.4的模擬腸液中電離成負離子，而季銨鹽基團在模擬腸液中以—N+(CH3)3的形式存在，與酮洛芬的靜電吸引和締合作用較強，釋放緩慢；在pH=1.2的模擬胃液中酮洛芬主要以分子形式存在，季銨鹽基團以N+(CH3)3Cl?形式存在，兩者之間的靜電吸引和締合作用減弱，釋放加快[14]。載藥QACS-mPEG微球與載藥QACS微球有相似的釋放規(guī)律，即在模擬胃液中的釋放速率大于在模擬腸液的釋放速率，在胃液和腸液中35h后的累積釋放率分別為81.4%和70.1%，且在腸液的緩釋效果優(yōu)于胃液，這可能是因為引入的mPEG含有—C—O—C—結構，能夠與酮洛芬形成氫鍵，帶正電的季銨鹽基團能夠與酮洛芬產生靜電締合作用，兩者的共同作用使得QACS-mPEG微球在模擬腸液中有較好的緩釋效果[15]。

3 結 論

圖5 載藥微球的藥物釋放曲線

將聚乙二醇單甲醚（mPEG）醛化改性后，通過西佛堿反應接枝到O-季銨化殼聚糖的NH2上，硼氫化鈉還原制得N-mPEG接枝O-季銨化殼聚糖。用反相懸浮法制備二乙烯基砜交聯(lián)QACS-mPEG微球。以酮洛芬為模型藥物，研究微球的載藥性能及釋放行為。結果表明，QACS-mPEG微球對酮洛芬的載藥量高于QACS微球和CS微球；載藥QACS-mPEG微球的累積釋放率大于QACS微球，并且在腸液的緩釋效果優(yōu)于胃液及載藥QACS微球，在藥物控釋領域具有一定的應用前景。

參 考 文 獻

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