HPLC－ELSD測(cè)定芪黃顆粒中的黃芪甲苷

崔春利 王 梅 郭東艷 唐志書(shū) 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽(yáng)712046）

芪黃顆粒為陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院運(yùn)用現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合理論在總結(jié)歷代名家治療的基礎(chǔ)上，結(jié)合多年臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)而研制的中藥復(fù)方顆粒，處方由黃芪、川芎、桑寄生、牛膝、牡丹皮、黃連、天麻等16味中藥組成，具有益氣養(yǎng)陰、化瘀清熱之功效，用于氣陰兩虛、瘀熱內(nèi)阻所致的疲乏氣短、心悸失眠、胸脅悶痛、腰膝酸軟、手足麻木、二便不調(diào)等癥，高血壓、冠心病、心功能不全、心律失常、高血脂等癥。方中黃芪補(bǔ)脾肺之氣，以益生血之源，為方中君藥?，F(xiàn)代研究表明，黃芪主含黃酮，皂苷及多糖類(lèi)成分，具有提高免疫、促進(jìn)胃腸運(yùn)動(dòng)、利尿與抗腎損傷、促進(jìn)造血、延緩衰老、抗肝損傷、降血糖、降血脂、降血壓等作用［1］。原制劑沒(méi)有選擇君藥進(jìn)行含量控制，為了更好的控制本品質(zhì)量，擬采用高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測(cè)法，對(duì)本制劑中君藥黃芪有效成分黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定。本研究結(jié)合文獻(xiàn)［2，3］采用 HPLC－ELSD 法對(duì)本制劑中黃芪甲苷進(jìn)行含量測(cè)定，取得了滿意的結(jié)果。本法操作簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可作為本制劑的質(zhì)量控制方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2695泵，Waters 2996二極管陣列檢測(cè)器，Empower色譜工作站（美國(guó) Waters公司）；GB－204電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）。

1.2 試藥 黃芪甲苷對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)110781－200613），芪黃顆粒（陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心提供，批號(hào)20110630，20110702，20110704），乙腈為色譜純，水為雙蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：依利特Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）；柱溫：室溫；流速：1.0mL／min；增益125，霧化室溫度50℃，漂移管溫度36℃，流動(dòng)相：乙腈－水（32∶68）。

在此條件下，理論板數(shù)分別以黃芪甲苷峰計(jì)算為5200，芪黃顆粒樣品中黃芪甲苷與相鄰雜質(zhì)峰均達(dá)到基線分離，缺黃芪的空白制劑樣品在黃芪甲苷峰處均無(wú)吸收，不干擾本品的測(cè)定。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取黃芪甲苷對(duì)照品各適量，精密稱(chēng)定，加甲醇制成每1mL含黃芪甲苷0.518mg對(duì)照溶液，搖勻，即得。

2.3 供試品溶液的制備 取裝量差異下的本品內(nèi)容物，研細(xì)，取約30g，精密稱(chēng)定，置索氏提取器中，加入甲醇40mL，冷浸過(guò)夜，再加甲醇適量，加熱回流4h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘?jiān)铀?0mL，微熱使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取4次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2次，每次40mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍 精密吸取黃芪甲苷對(duì)照品溶液（濃度為：0.518mg·mL－1）2，4，6，8和10μL，按上述色譜條件注入色譜儀，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣質(zhì)量的常用對(duì)數(shù)X為橫坐標(biāo)峰面積的常用對(duì)數(shù)Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程為：Y＝1.3267X＋5.2842，相關(guān)系數(shù)r＝0.9993。結(jié)果表明，黃芪甲苷在1.036～5.18μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取20110630批制劑樣品供試品溶液，并依據(jù)上述色譜條件，精密吸取該樣品溶液10μL，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，結(jié)果RSD為1.99%，表明本方法精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取20110630批制劑樣品6份，按供試溶液制備方法，制備樣品溶液，并依據(jù)上述色譜條件，精密吸取各樣品溶液10μL，進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果含量分別為：50.25，49.25，50.52，47.75，49.05和50.08μg／g，平均含量為49.48μg／g，結(jié)果RSD為2.07%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取20110630批制劑樣品按供試品溶液制備方法，制備樣品溶液，并依據(jù)上述色譜條件，分別于制樣后0，2，4和8h，吸取該樣品溶液10μL，進(jìn)樣、測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果RSD為1.41%，表明本品在8h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

圖1黃芪甲苷對(duì)照品、樣品、陰性樣品高效液相色譜圖

2.8 回收率實(shí)驗(yàn) 取一定量已知含量的20110630批制劑樣品（C＝49.48μg·g－1）6份，分別加入黃芪甲苷對(duì)照品各適量，依法制備供試品溶液。按上述色譜條件，精密吸取各供試品溶液10μL，注入色譜儀，測(cè)定峰面，并計(jì)算含量及回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 黃芪甲苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，本方法回收率良好。

2.9 樣品測(cè)定 取該制劑3批，各按供試品溶液制備方法，制備樣品溶液，并依據(jù)上述色譜條件，分別精密吸取各樣品溶液10μL，進(jìn)樣，記錄峰面積，結(jié)果3批芪黃顆粒中黃芪甲苷含量分別為61.24，57.00和56.42μg／g。

3 討論與小結(jié)

黃芪甲苷在紫外區(qū)為末端吸收，吸收波長(zhǎng)一般為203nm，采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，受試劑影響較大，操作條件非常嚴(yán)格，響應(yīng)峰面積信號(hào)較小，特別是復(fù)雜的中藥復(fù)方制劑芪黃顆粒，噪音對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響更大，紫外檢測(cè)幾乎看不到樣品峰。為此，采用了通用性質(zhì)量濃度型檢測(cè)器ELSD來(lái)檢測(cè)，聚焦待測(cè)物質(zhì)的量，樣品液中試劑被全部蒸發(fā)不干擾檢測(cè)，試驗(yàn)結(jié)果靈敏度，穩(wěn)定性及重復(fù)性均符合含量測(cè)定要求。

供試品溶液制備時(shí)，筆者考察了“先加水溶解再行水飽和正丁醇萃取法”與“先加甲醇回流提取，轉(zhuǎn)溶于水相，再行水飽和正丁醇萃取法”，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示后者含量顯著高于前者，故最終選用文中制備方法。

色譜條件摸索過(guò)程中，先后選擇熱電Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）Accurasil C18（250mm×4.6mm，5μm）及和依利特 Hypersil C18（250mm×4.6mm，5μm）型的色譜柱，結(jié)果色譜分離效果不佳，故最終選用該型號(hào)色譜柱。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：283－284.

［2］張 彤，黃順旺.HPLC－ELSD測(cè)定前列舒樂(lè)顆粒中黃芪甲苷［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（7）：82－83.

［3］薛巧如，翁雪萍，梁蔚陽(yáng).HPLC－ELSD測(cè)定前列通片中黃芪甲苷的含量［J］.中成藥，2007，29（10）：1558－1560.