扶正泄?jié)岜ＤI湯對腎功能衰竭大鼠腎組織smad4、smad7表達(dá)的影響＊

馬居里 耿翠翠 朱?；?嚴(yán)惠芳 白 潔 應(yīng)小平 冷 偉 張 賓 李 媛 楊 智

陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽712045）

慢性腎衰竭（chronic renal failure，CRF）簡稱慢性腎衰，是各種慢性腎臟疾病，引起腎功能和腎單位緩慢進(jìn)行性不可逆的喪失，導(dǎo)致以代謝產(chǎn)物和毒性產(chǎn)物潴留、水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂以及內(nèi)分泌失調(diào)為特征的臨床綜合征。扶正泄?jié)岜ＤI湯為陜西省名中醫(yī)馬居里教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方，該方對早、中期慢性腎功能衰竭有較好的療效，既往有實(shí)驗(yàn)研究表明該方具有降低腎衰大鼠Cr、BUN、血清瘦素作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察該方對慢性腎衰大鼠腎組織中Smad4、Smad7信號蛋白治療前后表達(dá)的影響，探討其抗腎間質(zhì)纖維化、延緩CRF進(jìn)展的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用藥及試劑 腺嘌呤（Adenine，C5H5N5），批號082013，上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；氯沙坦鉀（科素亞），批號110020，杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn)；扶正泄?jié)岜ＤI湯（蟲草菌粉、黃芪、生曬參、蒼術(shù)、熟地黃、當(dāng)歸、山藥、半夏、橘紅、茯苓、枳實(shí)、大黃、水蛭、車前子等），藥材購于陜中附院中藥房，由陜西中醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室制成濃縮液。Smad4試劑盒：批號BA1397，購于武漢博士德生物工程有限公司；Smad7試劑盒：批號990779W，購于北京博奧森生物有限公司；山羊抗兔（II抗）：批號CW0103，購于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物模型及分組 健康SD 雄性大鼠50只，5周齡，體重200±10g，由西安市灃渭新區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，合格證號：SCXK（陜）2007－001，適應(yīng)1周后，隨機(jī)分成2組：空白組（10只）、造模組（40只）。按200mg／kg·d 劑量將腺嘌呤制成混懸液1mL，每日晨8時(shí)給造模組大鼠灌胃喂藥［1］。造模全程24d，前12d，每日給藥1次；第13 天開始，隔日給藥1次。空白組不干預(yù)。造模后，將40只大鼠隨機(jī)分為模型組、科素亞組（5mg／kg）、扶正泄?jié)岜ＤI湯高、低劑量組（37.6g／kg、18.8g／kg），每組10 只。

1.3 給藥方法及喂養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)第25天開始，根據(jù)文獻(xiàn)［6］大鼠用量按人與動物體表面積的等效比值表折算給藥量。各治療組每日晨8時(shí)給予相應(yīng)藥物灌胃（10mL／kg），空白組和模型組各予生理鹽水，共治療30d。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中大鼠均自由攝食和飲用自來水，室溫控制在19～22℃，相對濕度維持在60%～70% 。

1.4 標(biāo)本采集 于實(shí)驗(yàn)第54d晨8時(shí)至次日晨8時(shí)，收集各組大鼠24h尿液，備測24h尿蛋白定量；后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，剪開胸腹腔，心臟取血5mL，備測BUN、Cr；處死大鼠，摘取腎臟，置10%的福爾馬林溶液中固定，送病檢。

1.5 圖像分析 采用分析測量圖象軟件Imagepro－Plus分別對各組免疫組化染色的腎臟標(biāo)本切片進(jìn)行測量。通過光學(xué)顯微鏡攝取圖像，輸入圖像分析軟件內(nèi)，進(jìn)行灰度變換，使陽性面積與背景分開，進(jìn)行自動測量。對每組切片隨機(jī)選取15個(gè)不重疊視野，計(jì)算陽性面積和整個(gè)視野面積的比值（去除腎血管腔所占面積），取其平均值進(jìn)行比較。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 一般情況觀察 空白組大鼠攝食量隨體重漸增，反應(yīng)靈敏、好動，體毛光滑、有光澤，耳廓、眼瞼結(jié)膜紅潤，舌質(zhì)紅，舌下靜脈無曲張，尾巴皮溫可，外陰周圍干燥，二便正常。模型組至灌服腺嘌呤起，大鼠逐漸出現(xiàn)體重增加較慢或減輕，攝食減少，精神萎靡，弓背蜷縮、腹部膨隆、喜臥懶動，體毛明顯脫落、干枯少澤，耳廓、眼瞼結(jié)膜蒼白，舌質(zhì)暗、有明顯瘀血象，尾巴皮膚發(fā)涼，外陰周圍有濕毛，大便溏、小便先增多后減少。隨著治療時(shí)間的延長，各治療組大鼠癥狀均有不同程度的改善。中藥高劑量組癥狀改善最為明顯；中藥低劑量組和科素亞組癥狀改善程度相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)全程死亡2只大鼠，造模過程中無大鼠死亡，在治療過程中模型組死亡1只，中藥低劑量組意外（灌入氣管）死亡1只。其余各組如數(shù)存活。

2.2 各組大鼠Scr、BUN 及24h尿蛋白定量檢測結(jié)果 見表1。

表1 各組大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白定量結(jié)果（±s）

表1 各組大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白定量結(jié)果（±s）

注：與空白組比較△P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.01；與中藥高劑量組比較◇P＜0.05；與中藥低劑量組比較◆P＞0.05。

組 別n（只）Scr（umol／L）BUN（mmol／L）尿蛋白定量（g／24h）10 56.7±10.22 7.92±1.42 4.53±0.67模型組9 165.33±12.24△18.12±1.98△8.39±0.99△中藥高劑量組10 83.80±10.58▲9.79±1.21▲5.37±1.09▲中藥低劑量組9 98.89±15.97▲◇11.48±1.39▲◇6.07±1.04▲◇科素亞組10 101.7±9.67▲◇◆11.81±1.25▲◇◆6.23±0.74空白組▲◇◆

2.3 腎組織Smad4、Smad7 蛋白的表達(dá) 見表2。免疫組化陽性表現(xiàn)呈黃褐色顆粒狀；Smad4蛋白主要在大鼠腎小球細(xì)胞胞漿內(nèi)和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；Samd7蛋白主要在腎小球細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá)，腎小管可見少量表達(dá)；空白組Smad4呈弱陽性表達(dá)；Samd7呈強(qiáng)陽性表達(dá)。模型組Smad4表達(dá)較空白組均明顯增強(qiáng)；而Smad7表達(dá)較空白組明顯減弱。中藥高、低劑量組、科素亞組Smad4表達(dá)較模型組明顯減弱，其中以中藥高劑量組表達(dá)減弱最明顯，中藥低劑量組和科素亞組表達(dá)程度相當(dāng)。而中藥高、低劑量組、科素亞組Smad7表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng)；其中以中藥高劑量組表達(dá)增強(qiáng)為著，中藥低劑量組、科素亞組表達(dá)程度相當(dāng)。

2.4 病理（HE染色） 空白組大鼠腎小球、腎小管、間質(zhì)均正常。模型組大鼠腎小球數(shù)量減少，部分腎小球萎縮；近曲小管上皮細(xì)胞可見灶狀、片狀壞死，內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤，腎小管內(nèi)可見顆粒管型，部分腎小管囊狀擴(kuò)張；間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生較明顯，血管未見異常。科素亞組大鼠腎小球數(shù)量輕度減少，少量腎小球萎縮；近曲小管上皮細(xì)胞可見灶狀壞死，內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤，腎小管管腔內(nèi)見少量脫落的上皮細(xì)胞及管型，偶見腎小管囊狀擴(kuò)張；間質(zhì)纖維結(jié)締組織輕度增生，血管未見異常。中藥低劑量組病變與科素亞組差異不大。中藥高劑量組大鼠腎小球數(shù)量無明顯減少，偶見腎小球萎縮；腎小管無明顯病變，管腔內(nèi)偶見管型；間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生不明顯，血管未見異常。

表2 各組大鼠Smad4、Smad7半定量結(jié)果（±s，%）

表2 各組大鼠Smad4、Smad7半定量結(jié)果（±s，%）

注：與空白組比較△P＜0.01；與模型組比較▲P＜0.01；與中藥高劑量組比較◇P＜0.05；與中藥低劑量組比較◆P＞0.05。

組 別n（只）Smad4Smad7空白組10 1.34±0.17 4.70±0.69模型組9 4.31±1.0△1.84±0.59△中藥高劑量組 10 2.46±0.51▲ 3.44±0.90▲中藥低劑量組9 3.62±0.87▲◇ 3.08±0.73▲◇科素亞組10 3.62±0.96▲◇◆2.80±0.93▲◇◆

3 討 論

Smads蛋白家族是近年來發(fā)現(xiàn)的新的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，按其結(jié)構(gòu)和功能分為3個(gè)不同的亞族：一是受體激活Smad（R－Smad），包括Smad1、2、3、5 和Smad8；二是共同通路Smad（Co－Smad），目前研究只發(fā)現(xiàn)Smad4；三是抑制性Smad（ISmad），包括Smad6和Smad7。研究發(fā)現(xiàn)Sand2、3、4、7均參與TGF－β／Samd信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。醫(yī)學(xué)公認(rèn)TGF－β是最主要的致纖維化因子，它參與腎間質(zhì)纖維化的各個(gè)環(huán)節(jié)，是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要病理機(jī)制［3］，但由于TGF－β的多效性，抗TGF－β治療可能引起其它潛在的生物效應(yīng)，采取針對TGF－β下游因子（如結(jié)締組織生長因子（CTGF）、Smad4、Smad7和細(xì)胞外基質(zhì)黏附蛋白（βig－h(huán)3））生物學(xué)效應(yīng)的藥物可能是相對安全并有效減輕和延緩間質(zhì)纖維化的新途徑［4］。許多中藥或者中藥復(fù)方制劑對腎間質(zhì)纖維化影響的研究已經(jīng)達(dá)到分子水平，大量的臨床及動物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明，一些中藥通過干預(yù)TGF－β／Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起到抗纖維化作用［5］。

慢性腎衰的中醫(yī)病機(jī)多為脾腎衰敗、氣血陰陽虧損，濕、濁、瘀、毒諸邪蘊(yùn)結(jié)三焦所致。臨床表現(xiàn)往往虛實(shí)互見、錯(cuò)綜復(fù)雜、變化多端，辨證治療上亦感棘手。馬居里教授依據(jù)“扶正固本，祛邪治標(biāo)”、“扶正不戀邪，祛邪不傷正”的治療原則，顧及該病的病理特點(diǎn)，建立了以補(bǔ)脾益腎，祛濕化濁，解毒活血通絡(luò)的扶正泄?jié)岜ＤI湯。該方中以蟲草菌粉、生曬參、黃芪、山藥、白術(shù)、茯苓補(bǔ)脾益腎，平調(diào)陰陽；橘紅、半夏、車前子、枳實(shí)、大黃理氣降逆和胃，祛濕化濁以解毒；熟地黃、當(dāng)歸、水蛭補(bǔ)血活血通絡(luò)。從現(xiàn)代藥理學(xué)研究分析，該方中黃芪、當(dāng)歸、蟲草［3］、大黃、水蛭均據(jù)用抗纖維化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明扶正泄?jié)岜ＤI湯能改善腎衰大鼠的一般情況；降低血清BUN、Cr、24h尿蛋白定量，改善腎功能；抑制Smad4蛋白陽性表達(dá)，促進(jìn)Smad7蛋白陽性表達(dá)，進(jìn)而抑制腎組織纖維化進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明扶正泄?jié)岜ＤI湯高劑量對大鼠腎組織Smad蛋白的表達(dá)影響較低劑量組和科素亞組明顯，病理改變也比低劑量組輕，有一定劑量相關(guān)，但本實(shí)驗(yàn)扶正泄?jié)岜ＤI湯僅設(shè)兩個(gè)劑量組，尚不能完全說明高劑量為治療慢性腎衰竭的有效劑量，關(guān)于扶正泄?jié)岜ＤI湯的有效劑量范圍和量效關(guān)系有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)；扶正泄?jié)岜ＤI湯方中單藥物是否對Smad蛋白有一定的調(diào)節(jié)作用也有待于我們研究。

［1］ 傅曉晴，林若勤，武一曼，等.腺嘌呤制作腎陽虛型慢性腎功能衰竭大鼠模型的生化研究［J］.福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，2（13）：22－24.

［2］ 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物學(xué)［M］.北京：人民軍醫(yī)出版社，2000，145－146.

［3］ 龔 偉，鄭敬民.轉(zhuǎn)化生長因子－β［J］.腎臟病與透析腎移植雜志，2004，13（6）：554－556.

［4］ Wang W，Koka V，Lan HY.Transforming growth factor－bata and smad signalingin kidney diseases.Nephrology（carlton），2005，10（1）：48－56.

［5］ 劉 鋰，張佩青.TGF－β／Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎纖維化中的作用機(jī)制及中藥的干預(yù)作用［J］.中醫(yī)藥信息，2007，24（2）：45－47.