基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法研究進(jìn)展

周愿，單亦初，張麗華*，張玉奎

(1.中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家色譜研究分析中心，遼寧大連 116023;2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100039)

對(duì)細(xì)胞、組織和整個(gè)生物體的表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行定量分析是后基因時(shí)代面臨的主要挑戰(zhàn)之一［1］。蛋白質(zhì)組定量分析可以分為相對(duì)定量和絕對(duì)定量［2］。相對(duì)定量是研究不同情況下同一蛋白質(zhì)組樣品組成含量的變化，如細(xì)胞受到刺激前后蛋白質(zhì)表達(dá)的差異;絕對(duì)定量是研究樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的具體量，如拷貝數(shù)或濃度。

早期的蛋白質(zhì)組定量主要利用雙向凝膠電泳或雙向差異凝膠電泳來實(shí)現(xiàn)。雖然該方法對(duì)蛋白質(zhì)分離具有較高的分辨率，然而無法對(duì)疏水、低豐度和翻譯后修飾蛋白質(zhì)進(jìn)行定量。近年來基于液相色譜-串級(jí)質(zhì)譜聯(lián)用的方法得到了快速發(fā)展，已成為蛋白質(zhì)組定量的主流技術(shù)。該方法可以分為無標(biāo)記定量法和穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量法。其中，基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組定量方法可以在不同步驟實(shí)現(xiàn)樣品混合，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記及消除色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析過程中不穩(wěn)定性帶來的定量誤差等優(yōu)點(diǎn)，已成為定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的方法。

根據(jù)同位素引入的方式，基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組定量方法可以分為代謝標(biāo)記法、化學(xué)標(biāo)記法和酶解標(biāo)記法。采用不同方法，標(biāo)記同位素的樣品在不同步驟混合;越早混合，樣品預(yù)處理步驟引入的誤差越小，定量的準(zhǔn)確度越高。進(jìn)行相對(duì)定量時(shí)，采用代謝標(biāo)記法則樣品在細(xì)胞水平混合;采用化學(xué)標(biāo)記法則樣品在蛋白質(zhì)或者肽段水平混合;采用酶解標(biāo)記法則樣品在肽段水平混合。進(jìn)行絕對(duì)定量時(shí)，樣品在蛋白質(zhì)或者肽段水平混合(見圖1)。本文結(jié)合近期發(fā)表的文獻(xiàn)，對(duì)基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組定量方法進(jìn)行綜述和評(píng)述。

圖1 基于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法及實(shí)驗(yàn)流程(改編自文獻(xiàn)［2，3］)Fig.1 Mass spectrometry-based quantitative proteomics methods and workflows(adapted from references［2，3］)

1 基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的相對(duì)定量方法

基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組相對(duì)定量方法分為基于一級(jí)質(zhì)譜(如細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記(SILAC)［4］、二甲基化標(biāo)記［5］等)和串級(jí)質(zhì)譜(如等重同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量方法(iTRAQ)［6］、等重肽末端標(biāo)記方法(IPTL)［7］等)的定量方法。前者通過比較輕重標(biāo)記的樣品在一級(jí)質(zhì)譜的峰強(qiáng)度/峰面積實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量分析;后者通過比較樣品在二級(jí)或者三級(jí)質(zhì)譜的特征性碎片離子的峰強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量分析。

1.1 基于一級(jí)質(zhì)譜的相對(duì)定量方法

適用于基于一級(jí)質(zhì)譜的相對(duì)定量方法的穩(wěn)定同位素標(biāo)記試劑種類多、數(shù)據(jù)分析軟件對(duì)其的支持較好，因此目前得到了較為廣泛的使用。常用的方法有SILAC、15N 標(biāo)記［8］、二甲基化標(biāo)記、質(zhì)量差異同位素標(biāo)記相對(duì)與絕對(duì)定量標(biāo)簽(mTRAQ)標(biāo)記［9］、18O標(biāo)記［10］等。其中SILAC和15N 為代謝標(biāo)記;二甲基化標(biāo)記和mTRAQ 為化學(xué)標(biāo)記;18O 標(biāo)記為酶解標(biāo)記。

1.1.1 基于代謝標(biāo)記的相對(duì)定量方法

代謝標(biāo)記是指在細(xì)胞或生物體成長過程加入含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的培養(yǎng)基，完成細(xì)胞或生物體標(biāo)記的方法。常見的代謝標(biāo)記方法有SILAC和15N 標(biāo)記法，尤其SILAC 法使用更為廣泛。該方法是在細(xì)胞培養(yǎng)過程中加入穩(wěn)定同位素標(biāo)記的必需氨基酸，如賴氨酸(K)和精氨酸(R)，使得每條肽段相差的質(zhì)量數(shù)恒定。與15N 方法相比，由于肽段的質(zhì)量差異數(shù)與氨基酸種類和數(shù)目無關(guān)，因此簡化了相對(duì)定量分析的難度。

為了解決SILAC 法只適用于細(xì)胞樣品分析的不足，發(fā)展了培養(yǎng)基衍生同位素標(biāo)簽(CDITs)［11］、同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)組(SILAP)［12］和超級(jí)SILAC(super-SILAC)［13］等方法。這些方法采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的細(xì)胞樣品作為內(nèi)標(biāo)，通過與不同狀態(tài)的組織樣品混合，實(shí)現(xiàn)了組織樣品蛋白質(zhì)組表達(dá)的差異分析。此外，為了便于考察在體內(nèi)蛋白質(zhì)組的動(dòng)態(tài)變化，如蛋白質(zhì)的生成和降解，脈沖SILAC(pulsed SILAC)［14，15］(見圖2)應(yīng)運(yùn)而生。該方法首先將經(jīng)過不同刺激的細(xì)胞在輕標(biāo)記的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，之后分別轉(zhuǎn)入中標(biāo)記和重標(biāo)記的培養(yǎng)液中培養(yǎng);通過比較中標(biāo)記和重標(biāo)記的比值，實(shí)現(xiàn)不同刺激條件下蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異分析。或?qū)⒃谳p標(biāo)記培養(yǎng)液中培養(yǎng)的細(xì)胞分成兩份，分別接受不同的刺激，并分別進(jìn)行中標(biāo)記和重標(biāo)記;再通過比較中、重標(biāo)記的比值，實(shí)現(xiàn)不同刺激條件下蛋白質(zhì)表達(dá)量的差異分析［15］。

為降低同位素峰的干擾對(duì)定量的影響，基于一級(jí)質(zhì)譜的定量方法通常要求MS1的質(zhì)量差大于4 Da。近期，Hebert 等［16］提出了中子編碼SILAC 法(NeuCode SILAC);利用13C、15N和2H 同位素因核結(jié)合能而導(dǎo)致的質(zhì)量虧損，通過高分辨(分辨率(Rs)＞200000)質(zhì)譜對(duì)這細(xì)微的差異進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)了采用不同穩(wěn)定同位素標(biāo)記的兩種蛋白質(zhì)組樣品的相對(duì)定量分析。該方法理論上可以實(shí)現(xiàn)多重樣品的標(biāo)記，但是對(duì)質(zhì)譜的分辨率要求極高。

圖2 脈沖SILAC 原理示意圖［14，15］Fig.2 Principle of pulsed SILAC［14，15］

雖然基于代謝標(biāo)記的方法在定量蛋白質(zhì)組領(lǐng)域得到了極為廣泛的使用，但是仍有一些不足:1)成本較高;2)難以用于人的組織樣品及體液的分析;3)同位素標(biāo)記氨基酸的使用會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達(dá)不同于非標(biāo)記蛋白質(zhì)的表達(dá)［17］;4)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中存在精氨酸向脯氨酸轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象。

1.1.2 基于化學(xué)標(biāo)記的相對(duì)定量方法

除代謝水平標(biāo)記外，通過體外化學(xué)標(biāo)記引入同位素是一種非常有價(jià)值的蛋白質(zhì)組相對(duì)定量方法;適用于細(xì)胞、體液、組織等多種樣品分析?，F(xiàn)有的化學(xué)標(biāo)記試劑多數(shù)通過與氨基或巰基反應(yīng)引入穩(wěn)定同位素。最常用的是基于N-羥基琥珀酰胺(NHS)化學(xué)和還原胺反應(yīng)，如mTRAQ和二甲基化標(biāo)記，其中二甲基化標(biāo)記使用更為廣泛。

Hsu 等［5］發(fā)展的二甲基化標(biāo)記是利用甲醛和氰基硼氫化鈉組合標(biāo)記肽段所有的活性氨基。該方法具有反應(yīng)條件溫和、快速、高效、無明顯副反應(yīng)、同位素試劑種類多、價(jià)格低廉等優(yōu)點(diǎn)。Raijmakers 等［18］使用預(yù)柱進(jìn)行在線標(biāo)記，不僅減少了標(biāo)記時(shí)間，而且降低了人為因素帶來的誤差，提高了定量的準(zhǔn)確性和精密度。該課題組［19］還實(shí)現(xiàn)了在線二甲基化標(biāo)記與二維液相色譜-基質(zhì)輔助激光解吸-飛行時(shí)間質(zhì)譜(2DLC-MALDI-TOF/TOF MS)的聯(lián)用。此外，Wang 等［20］在固相標(biāo)記后利用RPLC-SCX-RPLCESI-MS/MS 平臺(tái)分析了人肝癌樣品與正常組織樣品，發(fā)現(xiàn)了94種蛋白質(zhì)在肝癌樣品中上調(diào)，249種蛋白質(zhì)在肝癌樣品中下調(diào)。Boersema 等［21］建立了二甲基化標(biāo)記的標(biāo)準(zhǔn)流程，并分別建立了固相萃取柱標(biāo)記、溶液標(biāo)記和在線反相預(yù)柱標(biāo)記三種方法。Qin 等［22］以磷酸化功能修飾的有序介孔有機(jī)硅為吸附劑，實(shí)現(xiàn)了內(nèi)源性磷酸化肽段的富集和原位二甲基化標(biāo)記，并成功用于肝癌病人和正常人血液中內(nèi)源性磷酸肽的相對(duì)定量分析。Sun 等［23］在利用酰肼球富集糖肽的同時(shí)，進(jìn)行糖肽的原位二甲基化標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了高準(zhǔn)確、高回收率的糖蛋白質(zhì)組相對(duì)定量分析。

利用二甲基化標(biāo)記試劑的組合可以實(shí)現(xiàn)樣品的多重標(biāo)記，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)多種樣品的蛋白質(zhì)組相對(duì)定量。Boersema 等［24］利用CH2O和NaCNBH3、CD2O和NaCNBH3以及13CD2O和NaCNBD33種標(biāo)記試劑的組合，實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的三重標(biāo)記。Song 等［25］用輕、重試劑標(biāo)記相同的樣品，中標(biāo)試劑標(biāo)記另一份樣品，實(shí)現(xiàn)了準(zhǔn)三重標(biāo)記;通過比較輕重標(biāo)記，一次運(yùn)行可得到兩個(gè)定量結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了高準(zhǔn)確度和高精度的蛋白質(zhì)組相對(duì)定量分析。Hsu 等［26］利用CH2O、CD2O、NaCNBH3和NaCNBD34種試劑組合標(biāo)記Lys-C 酶解的肽段，實(shí)現(xiàn)了4種樣品的同時(shí)分析;利用CH2O、CD2O、13CD2O、NaCNBH3和NaCNBD3有機(jī)組合標(biāo)記Lys-C 酶解產(chǎn)物，還可以實(shí)現(xiàn)五重樣品的同時(shí)分析。

1.1.3 基于酶解標(biāo)記的相對(duì)定量方法

18O 標(biāo)記是目前酶解標(biāo)記的唯一方法［10］。采用該方法僅需要在酶解過程中使用H218O。使用的蛋白酶可以為胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、Glu 蛋白酶(Glu-C)和多肽內(nèi)切酶(Lys-C)等絲氨酸蛋白酶類;在這些酶的催化下，可以在肽段C 端增加2個(gè)18O 原子。18O 標(biāo)記既可用于非修飾蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量，而且也可以將肽段末端的18O 標(biāo)記與去糖鏈過程的18O 標(biāo)記相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)糖肽位點(diǎn)和糖鏈的相對(duì)定量分析［27，28］。此外，將iTRAQ和18O 標(biāo)記結(jié)合，還可以在實(shí)現(xiàn)糖蛋白質(zhì)樣品多重定量的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)糖肽位點(diǎn)的確認(rèn)［29］。將18O與二甲基化標(biāo)記相結(jié)合，還可基于等重標(biāo)記實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組的高精度和高準(zhǔn)確度的相對(duì)定量分析［30］。

近期基于固定化酶反應(yīng)器的酶解也逐漸被用于酶解標(biāo)記。該方法不僅能減少標(biāo)記過程中回交的發(fā)生，還能顯著提高標(biāo)記效率，縮短標(biāo)記時(shí)間［31，32］。

1.2 基于串級(jí)質(zhì)譜的相對(duì)定量方法

盡管基于一級(jí)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組定量方法種類多，應(yīng)用廣泛，但是仍存在以下問題:1)定量的準(zhǔn)確度受噪音離子的干擾，造成低峰強(qiáng)度組分的定量結(jié)果不準(zhǔn);2)定量動(dòng)態(tài)范圍低;3)難以實(shí)現(xiàn)同時(shí)超過四重標(biāo)記。為解決上述問題，近年來基于串級(jí)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組相對(duì)定量方法受到了越來越多的關(guān)注。

基于串級(jí)質(zhì)譜的蛋白質(zhì)組相對(duì)定量方法可以分為基于報(bào)告離子和碎片離子的兩種定量方法。前者主要是使用等重標(biāo)記試劑，如iTRAQ和串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽(TMT)［33］等，通過二級(jí)譜或三級(jí)譜的報(bào)告離子強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)定量;后者則利用不同標(biāo)記肽段的成對(duì)的碎片離子的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)定量。

1.2.1 基于報(bào)告離子的相對(duì)定量方法

iTRAQ［6］和TMT［33］是最常用的基于報(bào)告離子的蛋白質(zhì)組相對(duì)定量方法。其中利用iTRAQ 試劑可以實(shí)現(xiàn)八重標(biāo)記，利用TMT 試劑可以實(shí)現(xiàn)六重標(biāo)記。通過方法改進(jìn)或者與其他方法結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)更多重的標(biāo)記，進(jìn)而提高蛋白質(zhì)組相對(duì)定量的通量，是該類方法的研究目標(biāo)之一。Dephoure 等［34］將三重SILAC 標(biāo)記結(jié)合六重TMT 標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)了18種樣品的同時(shí)分析。Werner 等［35］和McAlister 等［36］利用高分辨質(zhì)譜將TMT 試劑由六重增加為八重，顯著提高了該方法的分析通量。近期也發(fā)展了一些新的基于報(bào)告離子的相對(duì)定量方法，包括N，N-二甲基化亮氨酸定量標(biāo)簽(N，N-dimethyl leucines，DiLeu)［37］、氘代等重氨基反應(yīng)標(biāo)簽(deuterium isobaric amine-reactive tags，DiART)［38］、加州理工等重標(biāo)記(Caltech isobaric tags，CIT)［39］、可裂解等重親和標(biāo)簽(cleavable isobaric labeled affinity tag，CILAT)［40，41］。其中CIT 可以根據(jù)需要設(shè)計(jì)試劑，實(shí)現(xiàn)n 重標(biāo)記;CILAT單次實(shí)驗(yàn)可以實(shí)現(xiàn)十二重標(biāo)記。

然而，等重標(biāo)記方法的不足在于，共洗脫組分和目標(biāo)組分在碎裂池內(nèi)共碎裂，會(huì)影響定量的準(zhǔn)確度，存在所謂的低估效應(yīng)(underestimation)，即在復(fù)雜生物樣品分析中，共碎裂的離子產(chǎn)生的報(bào)告離子會(huì)干擾目標(biāo)母離子在二級(jí)譜中報(bào)告離子的強(qiáng)度，使得實(shí)驗(yàn)中得到蛋白質(zhì)的定量結(jié)果低于真實(shí)值。為了解決該問題，Gygi 等［42］將二級(jí)譜中高強(qiáng)度的碎片離子進(jìn)一步碎裂，利用三級(jí)譜中的報(bào)告離子強(qiáng)度進(jìn)行定量。除此以外，Gygi 等［43］利用TMT 標(biāo)記在二級(jí)譜中會(huì)產(chǎn)生與TMT 報(bào)告離子互補(bǔ)的離子——TMT 互補(bǔ)離子(TMTC)，由于TMTC特異性強(qiáng)，通過去卷積處理也可以實(shí)現(xiàn)肽段的準(zhǔn)確定量。

1.2.2 基于碎片離子的相對(duì)定量方法

基于碎片離子的相對(duì)定量方法也可以解決基于報(bào)告離子的相對(duì)定量方法存在的低估效應(yīng)。該方法將肽段的N 端和C 端分別用輕標(biāo)和重標(biāo)試劑標(biāo)記，使肽段在一級(jí)質(zhì)譜上具有相同或相似的m/z 而無法分辨，在二級(jí)譜碎裂時(shí)會(huì)形成成對(duì)的碎片離子，利用這些碎片離子強(qiáng)度之比可以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的相對(duì)定量分析。等重肽末端標(biāo)記方法(IPTL)［7，44，45］是該類方法的第1個(gè)實(shí)例，并已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了3次技術(shù)更新，分別利用SA(succinic anhydride)及其同位素形式標(biāo)記肽段的N 端氨基、MDHI(2-methoxy-4，5-dihydro-1Himidazole)及其同位素形式標(biāo)記肽段的C 端賴氨酸上的氨基、利用2種肽段鑒定時(shí)得分值的不同實(shí)現(xiàn)肽段和蛋白質(zhì)的相對(duì)定量［7］。為了提高標(biāo)記效率和速度，該課題組［45］又開發(fā)了第二代IPTL。使用SA 標(biāo)記肽段的N 端氨基，同時(shí)使用甲醛標(biāo)記肽段的C 端賴氨酸上的氨基，并開發(fā)了基于強(qiáng)制搜索的IsobariQ 定量軟件。最近，為進(jìn)一步提高相對(duì)定量的通量和選擇性，該課題組［44］利用二甲基化標(biāo)記方法在酸性條件標(biāo)記肽段的N 端，堿性條件下標(biāo)記肽段的C 端賴氨酸上的氨基，并利用甲醛標(biāo)記試劑種類多的特點(diǎn)實(shí)現(xiàn)了三重標(biāo)記(見圖3)。這也是該類方法唯一實(shí)現(xiàn)多重標(biāo)記的實(shí)例。

等重末端標(biāo)記定量方法(QITL)［30］利用甲醛標(biāo)記肽段的N 端氨基，18O 標(biāo)記肽段的C 端(當(dāng)C 末端為K 時(shí)需要胍基化)，從而實(shí)現(xiàn)等重標(biāo)記。該方法定量覆蓋率接近85%，為現(xiàn)有該類方法中定量覆蓋率最高的方法。

除化學(xué)標(biāo)記外，代謝水平標(biāo)記也可以實(shí)現(xiàn)肽段的等重標(biāo)記。體內(nèi)終端氨基酸代謝標(biāo)記(IVTAL)［46］是在代謝水平實(shí)現(xiàn)等重標(biāo)記的實(shí)例之一。該方法在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)用(K6，R0)和(K0，R6)分別培養(yǎng)不同的細(xì)胞;混合后用Lys-N和Arg-C 兩種酶對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶切，其中一部分肽段會(huì)產(chǎn)生N端為K、C 端為R的序列。這些肽段在一級(jí)質(zhì)譜上沒有差異，而碎裂時(shí)會(huì)產(chǎn)生明顯的碎片離子對(duì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)組的相對(duì)定量。索引離子觸發(fā)二級(jí)譜離子定量方法(iMSTIQ)［47］是利用代謝標(biāo)記和化學(xué)標(biāo)記相結(jié)合的方法實(shí)現(xiàn)等重標(biāo)記。

基于碎片離子的蛋白質(zhì)組相對(duì)定量方法的優(yōu)點(diǎn)在于，可以克服使用離子阱類質(zhì)譜的1/3效應(yīng)，通過使用特征性的碎片離子，提高定量的準(zhǔn)確度和精密度。然而該方法同樣存在標(biāo)記步驟繁多、標(biāo)記選擇性和反應(yīng)效率有待提高，以及二級(jí)質(zhì)譜復(fù)雜度成倍增加會(huì)降低肽段得分、進(jìn)而減少可定性和定量的蛋白質(zhì)數(shù)目等問題。

2 基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的絕對(duì)定量方法

圖3 Triplex-IPTL 流程圖［44］Fig.3 Triplex-IPTL approach［44］

基于上述方法，實(shí)現(xiàn)上萬蛋白質(zhì)的相對(duì)定量分析已成為現(xiàn)實(shí)。然而，對(duì)于臨床診斷等，僅僅知道有哪些蛋白質(zhì)是差異蛋白質(zhì)尚無法滿足要求，仍需要知道目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量信息。

基于抗體的絕對(duì)定量方法(如酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA))具有很高的選擇性和靈敏度，但是受限于抗體種類，且分析通量有待提高?；谫|(zhì)譜的絕對(duì)定量方法能夠?qū)崿F(xiàn)多種目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量，因此受到了廣泛的關(guān)注。其中，基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記的絕對(duì)定量方法是向待測樣品中加入已知量的同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)肽段、蛋白質(zhì)或由多種目標(biāo)肽段構(gòu)建的串聯(lián)體，并以此衡量樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的量。

基于穩(wěn)定同位素標(biāo)記肽段為內(nèi)標(biāo)的絕對(duì)定量方法包括絕對(duì)定量法(AQUA)［48］、18O 標(biāo)記［31］、二甲基化標(biāo)記肽段［49］或者mTRAQ 標(biāo)記肽段［9］;同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)為內(nèi)標(biāo)的絕對(duì)定量方法包括全序列重標(biāo)記蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物絕對(duì)定量法(PSAQ)［50］、絕對(duì)SILAC 方法(absolute SILAC)［51］和全序列表達(dá)穩(wěn)定同位素標(biāo)記蛋白(FlexiQuant)［52］等;同位素標(biāo)記的串聯(lián)體為內(nèi)標(biāo)的絕對(duì)定量方法包括定量串聯(lián)體(Qcon-CAT)［53］、等電串聯(lián)體(iQCAT)［54］等;基于目標(biāo)蛋白質(zhì)片段的絕對(duì)定量方法包括蛋白抗原決定基標(biāo)簽(PrEST)［55］等。上述方法的實(shí)驗(yàn)流程［56］如圖4所示。由于內(nèi)標(biāo)與樣品混合的步驟越靠前，絕對(duì)定量的準(zhǔn)確度越高，因此理想的內(nèi)標(biāo)應(yīng)該是同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì);該蛋白質(zhì)應(yīng)具有與目標(biāo)蛋白質(zhì)相同的三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)、相同的翻譯后修飾和已知的蛋白質(zhì)濃度［57］。

2.1 以同位素標(biāo)記肽段為內(nèi)標(biāo)物的絕對(duì)定量方法

AQUA 方法［48］是將待測樣品酶解后加入已知量的人工合成的含有穩(wěn)定同位素標(biāo)記的肽段內(nèi)標(biāo)物或者用化學(xué)法標(biāo)記上同位素的肽段內(nèi)標(biāo)物，通過比較目標(biāo)肽段和添加內(nèi)標(biāo)物的信號(hào)強(qiáng)度，得到目標(biāo)肽段的含量。由于該方法內(nèi)標(biāo)肽容易從商業(yè)公司獲取，因而在絕對(duì)定量中得到了極為廣泛的應(yīng)用。基于相同的原理，在體外對(duì)目標(biāo)肽段進(jìn)行同位素標(biāo)記，如18O［31］、二甲基化［49］或者mTRAQ［9］標(biāo)記的肽段，也可以作為內(nèi)標(biāo)物加入到待測體系，用于實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)的定量。

圖4 基于穩(wěn)定同位素稀釋的蛋白質(zhì)絕對(duì)定量分析流程圖(改編自文獻(xiàn)［56］)Fig.4 Stable isotope dilution strategies for absolute quantification of targeted proteins(adapted from reference［56］)

然而由于該方法是在待測樣品酶解后加入內(nèi)標(biāo)物，忽視了樣品前處理過程引入的損失，因此定量結(jié)果有不確定性。此外，該方法成本較高，難以實(shí)現(xiàn)大量目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量分析。

2.2 以同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)為內(nèi)標(biāo)物的絕對(duì)定量方法

除了以標(biāo)記肽段為內(nèi)標(biāo)外，還可以將目標(biāo)蛋白質(zhì)全序列進(jìn)行同位素標(biāo)記，如PSAQ［50］，absolute SILAC［51］和FlexiQuant［52］等方法。通過這些方法，可以在細(xì)胞外或者細(xì)菌體內(nèi)代謝合成全長的同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)。純化后的蛋白質(zhì)可以直接加入到細(xì)胞提取液中，實(shí)現(xiàn)待測樣品中目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量。盡管采用該方法可以消除所有樣品處理過程引入的定量不確定性，但是僅適用于可溶性蛋白質(zhì)的定量分析。此外，標(biāo)記過程較為復(fù)雜，難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量。

2.3 以同位素標(biāo)記串聯(lián)體為內(nèi)標(biāo)物的絕對(duì)定量方法

QconCAT［53］利用了重組DNA 技術(shù)，將多種目標(biāo)蛋白質(zhì)的目標(biāo)肽段模擬構(gòu)建成新的蛋白質(zhì)，并將對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到細(xì)菌中，在含有同位素的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，從而引入同位素標(biāo)記蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)經(jīng)純化后，在酶解前加入到待測樣品的蛋白質(zhì)提取液中。該方法不僅可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量，而且可以消除酶解過程引入的誤差。盡管在理論上可以有效地產(chǎn)生目標(biāo)肽段，但是該蛋白質(zhì)與目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)不同，酶解效率也可能存在差別。此外，由于該方法無法用于蛋白質(zhì)樣品酶解前的分級(jí)過程，通常一種蛋白質(zhì)只能用一條肽段去定量，缺乏統(tǒng)計(jì)意義。

2.4 基于目標(biāo)蛋白質(zhì)片段的絕對(duì)定量方法

Mann 等［55］結(jié)合人PrEST與SILAC 方法，實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)蛋白質(zhì)的絕對(duì)定量。首先將PrEST 在E.coli體內(nèi)表達(dá)、純化并定量后，加入到SILAC 標(biāo)記的樣品中，并通過比較兩者的強(qiáng)度實(shí)現(xiàn)目標(biāo)的定量。該方法不僅可以實(shí)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)的同時(shí)定量，而且由于內(nèi)標(biāo)物可以在樣品預(yù)處理過程中加入，提高了定量的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論與展望

現(xiàn)有的蛋白質(zhì)組定量方法種類繁多，使用范圍廣泛，加速了生命科學(xué)的研究進(jìn)程。然而采用這些方法時(shí)，大部分實(shí)驗(yàn)過程都是離線操作。如何減少人為操作，實(shí)現(xiàn)樣品定量分析的在線化、集成化，進(jìn)而提高定量的通量、準(zhǔn)確度和精密度是該領(lǐng)域的發(fā)展方向之一。盡管已有許多商品化標(biāo)記試劑，但是仍需要不斷發(fā)展新型標(biāo)記試劑，并使其具有標(biāo)記方法簡單、高效、無副反應(yīng)、標(biāo)記后處理簡單、定量結(jié)果準(zhǔn)確、精密度高、動(dòng)態(tài)范圍寬、適用的樣品類型范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。此外，提高LC-MS，尤其是nanoLC-ESI MS的重現(xiàn)性，對(duì)于提高定量結(jié)果的精密度至關(guān)重要。質(zhì)譜儀掃描速度、質(zhì)量精度和分辨率的不斷提高，也必將為蛋白質(zhì)組定量新方法的發(fā)展提供新的機(jī)遇。

目前穩(wěn)定同位素標(biāo)記的蛋白質(zhì)組定量方法尚存在一些挑戰(zhàn)，包括如何實(shí)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)異構(gòu)體的定量分析、未知基因庫的生物蛋白質(zhì)表達(dá)譜和翻譯后修飾的動(dòng)態(tài)變化分析等。這些問題的解決，都亟須蛋白質(zhì)組定量新試劑、新技術(shù)和新方法的不斷發(fā)展。

［1］Bantscheff M，Lemeer S，Savitski M M，et al.Anal Bioanal Chem，2012，404(4):939

［2］Ong S E，Mann M.Nat Chem Biol，2005，1(5):252

［3］Bantscheff M，Schirle M，Sweetman G，et al.Anal Bioanal Chem，2007，389(4):1017

［4］Ong S E，Blagoev B，Kratchmarova I，et al.Mol Cell Proteomics，2002，1(5):376

［5］Hsu J L，Huang S Y，Chow N H，et al.Anal Chem，2003，75(24):6843

［6］Ross P L，Huang Y N，Marchese J N，et al.Mol Cell Proteomics，2004，3(12):1154

［7］Koehler C J，Strozynski M，Kozielski F，et al.J Proteome Res，2009，8(9):4333

［8］Oda Y，Huang K，Cross F R，et al.Proc Natl Acad Sci U S A，1999，96(12):6591

［9］DeSouza L V，Taylor A M，Li W，et al.J Proteome Res，2008，7(8):3525

［10］Yao X，F(xiàn)reas A，Ramirez J，et al.Anal Chem，2001，73(13):2836

［11］Ishihama Y，Sato T，Tabata T，et al.Nat Biotechnol，2005，23(5):617

［12］Yu K H，Barry C G，Austin D，et al.J Proteome Res，2009，8(3):1565

［13］Geiger T，Cox J，Ostasiewicz P，et al.Nat Methods，2010，7(5):383

［14］Selbach M，Schwanhausser B，Thierfelder N，et al.Nature，2008，455(7209):58

［15］Schwanhausser B，Gossen M，Dittmar G，et al.Proteomics，2009，9(1):205

［16］Hebert A S，Merrill A E，Bailey D J，et al.Nat Methods，2013，10(4):332

［17］Filiou M D，Varadarajulu J，Teplytska L，et al.Proteomics，2012，12(21):3121

［18］Raijmakers R，Berkers C R，de Jong A，et al.Mol Cell Proteomics，2008，7(9):1755

［19］Raijmakers R，Heck A J，Mohammed S.Mol BioSyst，2009，5(9):992

［20］Wang F，Chen R，Zhu J，et al.Anal Chem，2010，82(7):3007

［21］Boersema P J，Raijmakers R，Lemeer S，et al.Nat Protoc，2009，4(4):484

［22］Qin H，Wang F，Wang P，et al.Chem Commun(Camb)，2012，48(7):961

［23］Sun Z，Qin H，Wang F，et al.Anal Chem，2012，84(20):8452

［24］Boersema P J，Aye T T，van Veen T A，et al.Proteomics，2008，8(22):4624

［25］Song C，Wang F，Ye M，et al.Anal Chem，2011，83(20):7755

［26］Hsu J L，Huang S Y，Chen S H.Electrophoresis，2006，27(18):3652

［27］Shakey Q，Bates B，Wu J.Anal Chem，2010，82(18):7722

［28］Liu Z，Cao J，He Y，et al.J Proteome Res，2009，9:227

［29］Zhang S，Liu X，Kang X，et al.Talanta，2012，91:122

［30］Yang S J，Nie A Y，Zhang L，et al.J Proteomics，2012，75(18):5797

［31］Qin W，Song Z，F(xiàn)an C，et al.Anal Chem，2012，84(7):3138

［32］Mirza S P，Greene A S，Olivier M.J Proteome Res，2008，7(7):3042

［33］Thompson A，Schafer J，Kuhn K，et al.Anal Chem，2003，75(8):1895

［34］Dephoure N，Gygi S P.Sci Signal，2012，5(217):rs2

［35］Werner T，Becher I，Sweetman G，et al.Anal Chem，2012，84(16):7188

［36］McAlister G C，Huttlin E L，Haas W，et al.Anal Chem，2012，84(17):7469

［37］Xiang F，Ye H，Chen R，et al.Anal Chem，2010，82(7):2817

［38］Zhang J，Wang Y，Li S.Anal Chem，2010，82(18):7588

［39］Sohn C H，Lee J E，Sweredoski M J，et al.J Am Chem Soc，2012，134(5):2672

［40］Li S，Zeng D.Chem Commun，2007(21):2181

［41］Zeng D，Li S.Bioorg Med Chem Lett，2009，19(7):2059

［42］Ting L，Rad R，Gygi S P，et al.Nat Methods，2011，8(11):937

［43］Wühr M，Haas W，McAlister G C，et al.Anal Chem，2012，84(21):9214

［44］Koehler C J，Arntzen M O，de Souza G A，et al.Anal Chem，2013，85(4):2478

［45］Koehler C J，Arntzen M O，Strozynski M，et al.Anal Chem，2011，83(12):4775

［46］Nie A Y，Zhang L，Yan G Q，et al.Anal Chem，2011，83(15):6026

［47］Yan W，Luo J，Robinson M，et al.Mol Cell Proteomics，2011，10(3):M110.005611

［48］Gerber S A，Rush J，Stemman O，et al.Proc Natl Acad Sci U S A，2003，100(12):6940

［49］Ji C，Sadagopan N，Zhang Y，et al.Anal Chem，2009，81(22):9321

［50］Brun V，Dupuis A，Adrait A，et al.Mol Cell Proteomics，2007，6(12):2139

［51］Hanke S，Besir H，Oesterhelt D，et al.J Proteome Res，2008，7(3):1118

［52］Singh S，Springer M，Steen J，et al.J Proteome Res，2009，8(5):2201

［53］Rivers J，Simpson D M，Robertson D H，et al.Mol Cell Proteomics，2007，6(8):1416

［54］Austin R J，Chang D K，Holstein C A，et al.Proteomics，2012，12(13):2078

［55］Zeiler M，Straube W L，Lundberg E，et al.Mol Cell Proteomics，2012，11(3):O111.009613

［56］Rodríguez-Suárez E，Whetton A D.Mass Spectrom Rev，2013，32(1):1

［57］Simpson D M，Beynon R J.Anal Bioanal Chem，2012，404(4):977