高效液相色譜法測定白子菜中蘆丁的含量

王中華，陳 濤

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

白子菜（Crynura divaricata（L.）DC.）為菊科土三七屬植物，其根、莖、葉均可入藥。其根性味甘、涼,能清熱涼血,散淤消腫。其莖、葉性味咸微辛、寒,有毒,具有清熱,舒筋,止血,祛痰之功效。白子菜地上部分可作為藥食兩用之品，廣泛用于治療高血壓病、高脂血癥及糖尿病等，故有“神仙草”之稱。白子菜地上部分含有豐富的黃酮類成分，現(xiàn)代藥理學研究也表明，黃酮類化合物有較好的降血糖作用。對于白子菜的研究目前還處于基礎階段。迄今為止，關于白子菜中黃酮類化合物的研究，國內(nèi)外的報導較少，還沒有利用高效液相色譜法對其進行檢測和含量測定的相關研究。本文參照高效液相色譜法實驗[1]，采用高效液相色譜法對白子菜葉中黃酮類化合物的（以蘆丁計）含量進行分析測定，對色譜條件進行優(yōu)化選擇，分析結果表明此法簡單快速、準確靈敏。本研究為分析白子菜中黃酮類化合物的藥用價值提供相關的理論依據(jù).可為白子菜的開發(fā)利用提供相應的參考,具有一定的實用意義。

1 實驗材料

1.1 儀器 Waters 600 E高效液相色譜儀；Waters 2998二極管陣列檢測器；Waters Empower數(shù)據(jù)工作站；FA1104電子分析天平（上海精科天平廠）；DK98-1型電熱恒溫水浴鍋（雙列六孔、天津中環(huán)科技開發(fā)公司）；ACO-3120型真空泵（上海會行農(nóng)機廠）；超聲處理器（北京醫(yī)療設備二廠）；藥典篩（浙江五星沖壓篩具廠）；101-2BS電熱恒溫干燥箱（天津中環(huán)實驗電爐有限公司）；ZDHW調(diào)溫型電熱套（5000 mL河北省黃驊中性儀器有限公司）；DL-1單聯(lián)電爐（2000 W北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；玻璃儀器等。

1.2 試藥與試劑 樣品：白子菜（采集于天津中醫(yī)藥大學植物藥種植基地，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學藥用植物學研究室李天祥教授鑒定為菊科植物白子菜。對照品：蘆?。ㄙ徸灾袊幤飞镏破窓z定所，供含量測定用，批號：100080-200707）。甲醇、乙腈，磷酸等為色譜純，其余試劑均為分析純；水為蒸餾水。

2 實驗方法與結果

2.1 方法學的考察

2.1.1 檢測波長的測定 參照《中國藥典》2010年版一部“槐花”項下蘆丁的檢測波長，用Waters 600 E高效液相色譜儀，流動相為甲醇-1%冰醋酸（40∶60），在波長200～600 nm進行掃描，蘆丁對照品在360 nm處有最大吸收峰，最終確定360 nm為檢測波長。

2.1.2 流動相的考察 參考相關文獻[2]，篩選出四組流動相即：甲醇-0.4%磷酸（50:50）；甲醇-2%磷酸（45∶55）；乙腈-0.4%磷酸（20∶80）；甲醇-1%冰醋酸（40∶60）；在相同的檢測波長、流速、進樣量的情況下，由于前三組出峰時間偏短，基線分離不好，所以最終確定流動相為：“甲醇-1%冰醋酸（40∶60）”，色譜柱:Xterra@RP185um，柱溫30℃，流速1 mL/min，檢測波長360 nm，進樣量20 μL。

2.1.3 提取方法的考察 先將白子菜樣品進行前處理,以石油醚（30～60℃）回流提取3 h后干燥備用。然后篩選出三種提取方法即：取樣量1.000 g，60%乙醇40 mL超生提取15min；取樣量2.000 g，加甲醇20 mL超生提取15min；取樣量3.000 g，60%乙醇30 mL與25%硫酸3mL，回流提取3 h后乙酸乙酯萃取[2]。在相同的色譜條件下：進樣量20 μL”進行檢測，結果顯示，取樣量1.000 g，60%乙醇40mL，超生提取15 min的條件出峰時間、峰面積、峰型、基線分離度均較好，所以確定其為最佳提取方法。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對照品1.00 mg，用甲醇定容至10 mL的容量瓶中，即為蘆丁對照品溶液（濃度0.10 mg/mL）

2.2.2 供試品的前處理 取白子菜的地上部分成熟的葉片，去塵土洗凈晾干，置于烘干箱內(nèi)以60℃干燥2.5 h使葉片水分基本蒸發(fā)，葉片呈土黃色質(zhì)脆易碎，藥用粉碎機粉碎至能過1 mm孔徑篩的粗粉，置于干燥的容器中備用。

精密稱取白子菜粗粉3.006 g和3.007 g，分別加石油醚（30～60℃）150 mL，置于索式提取器中回流提取 3 h（料液比 1∶50，水浴溫度 55 ℃），濾過，棄去石油醚提取液，藥粉殘渣置蒸發(fā)皿中水浴60℃、20 min揮干石油醚，后置于干燥容器中備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密稱取經(jīng)前處理的白子菜粗粉1.000 g和1.001 g，各加60%乙醇40 mL（料液比1∶40），置于100 mL三角瓶中稱質(zhì)量，靜置30 min，置超聲提取器中（頻率 50 Hz，功率500 W，溫度56℃）提取15 min，取出冷卻至常溫再稱質(zhì)量，用60%的乙醇補重，過濾，濾液備用[3]。殘渣再按以上方法提取一次。合并兩次濾液，用60%乙醇分別定容至100 mL的容量瓶中，用0.45 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，此即為白子菜的供試品溶液。

2.3 線性關系的考察 精密稱取干燥的蘆丁對照品20.0 mg，加甲醇100 mL配制成0.20 mg/mL的標準液。精密吸取對照品溶液 1、2、3、3.5、5、6 mL 分別置于25 mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，搖勻。精密量取20 μL注入液相色譜儀，記錄蘆丁峰面積。以對照品濃度（mg/mL）為橫坐標，峰面積值為縱坐標進行線性回歸的計算，得蘆丁標準曲線（如圖1），表明在0.0112～0.0672 mg/mL范圍內(nèi)線性關系良好。

2.4 精密度實驗 精密吸取上述對照品溶液，連續(xù)進樣6次，每次20 μL，測定蘆丁峰面積的相對標準偏差（RSD）為0.837%，表明儀器精密度良好。

2.5 重復性實驗 取經(jīng)“2.2.2”前處理后白子菜供試品，按“2.2.3”供試品溶液制備操作，按“2.1”方法學考察中確定的色譜條件，連續(xù)進樣6次，每次20 μL，測得其峰面積的相對標準偏差（RSD）為1.76%，符合要求。

2.6 重現(xiàn)性實驗 取經(jīng)“2.2.2”前處理后白子菜供試品，按“2.2.3”供試品溶液制備操作，配制平行樣6份，按“2.1”方法學考察中確定的色譜條件，每次20 μL，計算蘆丁平均含量為 0.729（mg/g），相對標準偏差（RSD）為1.49%，符合要求。

2.7 穩(wěn)定性實驗 取經(jīng)“2.2.2”前處理后白子菜供試品，按“2.2.3”項下制備供試品溶液，以“2.1”方法學考察中確定的色譜條件，分別在 0、2、4、6、8、10、12 h測定，結果蘆丁峰面積的相對標準偏差（RSD）為1.76%，表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗 精密稱取經(jīng)“2.2.2”前處理后的白子菜供試品6份，每份1 g，分別置100 mL具塞錐形瓶中，分別精密加入3 mL蘆丁對照品溶液（濃度 0.10 mg/mL），同“2.2.3”項下制備供試品溶液。依法測定結果，結果顯示供試品的平均回收率為98.7%，見表1。

表1 加樣回收率實驗結果（n＝6）Tab.1 Experimental results of average recovery（n＝6）

2.9 樣品的含量測定 分別精密吸取供試品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，在流動相為甲醇—1%冰醋酸（40∶60），柱溫 30 ℃，流速 1 mL/min,檢測波長360 nm，每隔2 h進樣1次，共進樣6次，取平均值按回歸方程計算蘆丁的含量，結果樣品中蘆丁的平均含量為 0.729（mg/g），相對標準偏差（RSD）為1.49%（n=6）。（見表 2、圖 2、圖 3）。

表2 樣品的含量測定（n＝6）Tab.2 Assaying of samples（n＝6）

3 討論

實驗結果表明，依據(jù)本實驗考察確定的檢測標準，對白子菜中蘆丁的含量采用高效液相色譜法進行測定，其結果蘆丁的峰形對稱，與相鄰雜質(zhì)峰達到基線分離，蘆丁濃度與峰面積極顯著相關，回歸方程為：y贊=11.298x+0.0521，r=0.9991，結果顯示白子菜中蘆丁的平均含量為0.729（mg/g）。本方法操作簡便，靈敏度和精密度較高，可用于含蘆丁天然植物及其制劑的質(zhì)量控制和檢測。

白子菜抗逆性強，已實現(xiàn)人工栽培，栽培容易，生長周期短，產(chǎn)量高，實際生產(chǎn)中每667 m2，年可收獲葉和嫩莖5000～8000 kg。對其深入開發(fā)和研究可提高其營養(yǎng)價值、使用價值和經(jīng)濟價值，有利于資源的開發(fā)利用，可作為綠色天然功能食品，改善人們的膳食結構，提高人們的健康水平。

鑒于白子菜資源豐富，深入研究白子菜提取物的藥用和臨床價值，尤其是對糖尿病患者的降糖作用機制，以及其對小腸內(nèi)α-葡萄糖苷酶活性的影響[4]。為其開展對糖尿病的預防和治療，建立相關的理論基礎。

未來還應進一步建立白子菜黃酮類化合物中的槲皮素[5]、以及多糖類成分的含量測定方法和標準。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.

[2] 王津江.白背三七總黃酮的提取工藝研究[J].中國藥師，2009，12（2）：146-149.

[3] 李 輝.超聲輔助提取白背三七總黃酮[J].食品科學，2011，32（14）：144-146.

[4] 馬正東.白背三七水提取物對2型糖尿病大鼠的降血糖作用及其機制[J].中草藥，2010，41（4）：623-626.

[5] 冼寒梅.白子菜藥材薄層色譜鑒別的實驗研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2008，35（2）：259-260.