炭疽PA和芽孢雙組分候選疫苗免疫豚鼠的免疫學(xué)初步評價

盧錦標(biāo)，魏東，王國治

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炭疽PA和芽孢雙組分候選疫苗免疫豚鼠的免疫學(xué)初步評價

盧錦標(biāo)，魏東，王國治

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室

對豚鼠免疫重組 PA 抗原和甲醛滅活芽孢組成的炭疽候選疫苗，評價其免疫效果。

將豚鼠隨機(jī)分成 5 個實驗組，分別免疫高、中、低劑量候選疫苗、炭疽活疫苗或生理鹽水；免疫后不同時間點采血進(jìn)行抗體檢測、XTT 法淋巴細(xì)胞增殖檢測以及皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)檢測。

抗體檢測結(jié)果顯示，雙組分炭疽候選疫苗能誘導(dǎo)較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答；XTT 細(xì)胞增殖結(jié)果顯示，外周血淋巴細(xì)胞特異性增殖不明顯，但所有候選疫苗組針對 rPA DTH 陽轉(zhuǎn)率 24 h 后均為 100%。

雙組分炭疽候選疫苗能誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答。

芽孢桿菌，炭疽； 炭疽菌苗； 豚鼠； 免疫評價

炭疽是由炭疽桿菌引起的人畜共患傳染病。受炭疽桿菌感染的食草動物是人類最主要的傳染源，雖然人類中的炭疽發(fā)病率并不高[1]，但炭疽桿菌作為細(xì)菌戰(zhàn)或生物恐怖襲擊首選，如 2001 年美國炭疽郵件事件，潛在威脅不容忽視。

我國現(xiàn)用的炭疽疫苗是人用減毒活疫苗，主要成分是活的炭疽芽孢，采用皮上劃痕接種方式，存在接種劑量難以保證，副反應(yīng)較重等問題。國外常用的炭疽疫苗有 AVA（美國）和 AVP（英國），由減毒株培養(yǎng)后，除菌濾液加氫氧化鋁吸附制備而成，保護(hù)性抗原（protective antigen，PA）是其中最主要的免疫原，其他抗原成分較復(fù)雜，存在難定性定量，批間變異大等問題。我國目前的炭疽病預(yù)防預(yù)案是以化學(xué)藥品預(yù)防為主，在服用化學(xué)藥品時給予活疫苗接種，可能造成接種無效，同時化學(xué)預(yù)防還有產(chǎn)生耐藥菌的可能，且可能對用作生物武器的抗多種常見藥物的炭疽桿菌無效。因此，研究一種新型且安全有效的炭疽疫苗尤為重要。

上述兩種類型的炭疽疫苗組成雖不同，但達(dá)到的免疫保護(hù)效果相近，提示除了 PA，炭疽芽孢中的抗原對免疫保護(hù)效果也起著重要作用[2-3]。本研究利用重組 PA 抗原（rPA）和甲醛滅活芽孢（formaldehyde inactivatedspores，F(xiàn)IS），經(jīng)氫氧化鋁凝膠吸附后制備炭疽雙組分候選疫苗，在豚鼠模型中，評價該候選疫苗的免疫應(yīng)答，為炭疽新疫苗的改進(jìn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑和儀器 rPA 抗原和甲醛滅活芽孢由中國食品藥品檢定研究院結(jié)核病疫苗室制備；Al(OH)3佐劑為德國 Brenntag 公司產(chǎn)品；XTT 和吩嗪硫酸甲酯（PMS）為美國 Sigma 公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗豚鼠 IgG 為美國 Santa Cruz biotechnology 公司產(chǎn)品；豚鼠淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物技術(shù)有限責(zé)任公司；MK3 酶標(biāo)儀為芬蘭 Labsystems Dragon 公司產(chǎn)品。

1.1.2 實驗動物 SPF 級 Hartley 豚鼠，6 ~ 8 周齡，由中國食品藥品檢定研究院實驗動物中心提供。實驗動物使用許可證號：scxk（京）2009-0017。實驗過程中飼養(yǎng)于中國食品藥品檢定研究院清潔級動物房。

1.2 方法

1.2.1 分組及免疫 將 40 只豚鼠隨機(jī)分為 5 組，每組 8 只，雌雄各半。①對照組：Al(OH)3佐劑；②高劑量組：40 μg rPA + 4 億 FIS + Al(OH)3；③中劑量組：20 μg rPA + 2 億 FIS + Al(OH)3；④低劑量組：10 μg rPA + 1 億FIS + Al(OH)3；⑤活疫苗組：皮上劃痕用炭疽活疫苗（5.0 × 107/只）。前 4 組第 0 周、第 2 周免疫，第 5 組僅第 0 周免疫，注射部位均為后肢肌內(nèi)。

末次免疫后 1 周、3 周對每只動物進(jìn)行心臟抽血，用豚鼠淋巴細(xì)胞分離液分離出淋巴細(xì)胞（PBMC）進(jìn)行 XTT 增殖檢測。末次免疫后 3 周、5 周心臟抽血，分離血清，用于豚鼠 ELISA 抗體檢測。

1.2.2 抗體檢測 將 rPA 和 FIS 分別以 5 μg/ml和 1 億/ml 包被 96 孔酶標(biāo)板，4 ℃過夜。封閉液 37 ℃封閉 2 h 后，每孔加入 100 μl 的 500 倍開始倍比稀釋的待檢血清，于 37 ℃反應(yīng) 1 h。顯色時，每孔加入 100 μl TMB 底物液，37 ℃放置5 ~ 10 min 后，每孔加入 2 mol/L 的 H2SO450 μl 終止液終止反應(yīng)。檢測吸光值450 nm。以大于佐劑對照組吸光值 2.1 倍的最大稀釋倍數(shù)為待檢血清的抗體效價，取其 10 為底的對數(shù)值。

1.2.3 淋巴細(xì)胞增殖試驗（XTT法） 分離的 PBMC 調(diào)整濃度為 2.5 × 106/ml，每孔 100 μl 加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。用 1640 完全培養(yǎng)基稀釋 rPA 抗原成 20 μg/ml，稀釋 FIS 為 0.2億/ml，各加100 μl/孔，均做復(fù)孔，同時用 1640 完全培養(yǎng)基作陰性對照，ConA 作陽性對照。在 37 ℃，5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 72 h。

培養(yǎng)結(jié)束后，配制 PMS/XTT 混合液：分別稱量 PMS 0.0081 g 溶于10 ml PBS、XTT 0.01 g 溶于 10 ml PBS，兩者以 1:20 體積比混合，過0.22 μm 濾膜除菌。每孔加 40 μl PMS/XTT 混合液，于 37 ℃，5% CO2的二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng) 6 h。置酶聯(lián)檢測儀上測定吸光度，檢測波長 450 nm，參考波長 630 nm。取復(fù)孔吸光值平均值，以公式 SI =450/630 nm實驗孔/450/630 nm對照孔計算刺激指數(shù)。

1.2.4 rPA 的皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)（DTH） 參考《中國藥典》方法[4]，于疫苗末次免疫后第 5 周，暴露豚鼠一側(cè)皮膚，除毛，皮內(nèi)注射 50 μg/ml 的 rPA 抗原 0.2 ml，于 24 h 后觀察注射部位皮膚有無紅腫，并測量腫塊直徑大小，以紅腫直徑超過5 mm × 5 mm 判定為陽性反應(yīng)，計算陽性反應(yīng)發(fā)生率。

圖 1 抗 rPA 抗原 IgG 抗體效價

Figure 1 Anti-rPA IgG antibody titer

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 抗原特異性抗體效價

2.1.1 抗 rPA 抗體結(jié)果 免疫后第 3 周，高、中、低劑量組動物均能產(chǎn)生高滴度抗體，活疫苗組未檢測到 rPA 抗體。至第 5 周，高、中、低劑量組動物抗體效價較第 3 周有小幅下降，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05），同時活疫苗組可檢測出高滴度抗體（圖 1）。

2.1.2 抗 FIS 抗體結(jié)果 免疫后第 3 周，高、中、低劑量組動物均能產(chǎn)生高滴度 FIS 抗體，活疫苗組未檢測到 FIS 抗體。至第 5 周，高劑量組動物抗體效價較第 3 周有小幅下降，中、低劑量組動物抗體效價較第 3 周有小幅上升，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（> 0.05），同時活疫苗組可檢測出高滴度 FIS 抗體，但顯著低于同一時間點的其他 3 組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（< 0.001）（圖2）。

2.2 抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖

2.2.1 rPA 抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖 在末次免疫后第 1 周及第 3 周，各試驗組淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)與 Al(OH)3佐劑對照組比較，均無顯著差異（> 0.05）（圖 3）。

圖 2 抗 FIS 抗原 IgG 抗體效價（***P < 0.001)

Figure 2 Anti-FIS IgG antibody titer (***< 0.001)

圖 3 rPA 抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖

Figure 3 rPA-specific lymphocyte proliferation

2.2.2 FIS 抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖 在末次免疫后第 3 周，各試驗組淋巴細(xì)胞刺激指數(shù)與 Al(OH)3佐劑對照組比較，均無顯著差異（> 0.05）（圖 4）。

圖 4 FIS 抗原特異性的淋巴細(xì)胞增殖

Figure 4 FIS antigen-specific lymphocyte proliferation

2.3 rPA 皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)實驗

皮內(nèi)注射 50 μg/ml 的 rPA 抗原 0.2 ml，24 h 后注射部位均能觀察到紅腫出現(xiàn)。以大于 5 mm ×5 mm的紅腫為陽性反應(yīng)，結(jié)果顯示，高劑量組、中劑量組、低劑量組和活疫苗組的陽性反應(yīng)發(fā)生率均為 100%，對照組無明顯紅腫，也無硬結(jié)塊。

3 討論

當(dāng)前，新型炭疽疫苗的設(shè)計對 PA 的主導(dǎo)作用已達(dá)成共識，作為炭疽的主要免疫原，PA 對炭疽的預(yù)防保護(hù)有著關(guān)鍵作用，以 PA 為主要成分的疫苗通過誘導(dǎo)產(chǎn)生 PA 抗體對炭疽毒素產(chǎn)生中和作用，從而達(dá)到保護(hù)效果。但單一的 PA 組分對吸入性炭疽保護(hù)效果較差，對于部分免疫功能低下人群，PA 疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的 PA 抗體滴度不高，也不足以提供完全的保護(hù)；另一方面，PA 疫苗，如AVA，對自然界某些炭疽桿菌分離株效果不佳[5]。同時考慮到炭疽桿菌在生命周期的不同形態(tài)，從芽孢出芽增殖，到營養(yǎng)態(tài)細(xì)胞，再到休眠體芽孢，能產(chǎn)生多種毒力因子，包括莢膜、外毒素等，可能存在多種具有保護(hù)作用的抗原。大量研究也表明，除了 PA，炭疽桿菌其他組分的抗原對疫苗的免疫保護(hù)效果起著重要作用[3, 6-8]。因此，單純的 PA 疫苗需要改進(jìn)成針對性更廣泛的多靶向性疫苗，如 PA 加滅活芽孢，PA 加滅活菌體，PA 加莢膜多糖等。之前我們在小鼠模型上評價了 rPA 與滅活炭疽菌體抗原組成的雙組分疫苗[9]，本研究中，我們用 rPA 與甲醛滅活芽孢配伍，在豚鼠模型上初步評價該候選疫苗的免疫應(yīng)答。

抗體檢測結(jié)果表明，rPA 聯(lián)合 FIS 免疫豚鼠后，高、中、低劑量組均可誘導(dǎo)產(chǎn)生高滴度 rPA 抗體和炭疽芽孢抗體，這對接種動物抵抗炭疽菌的毒素起到關(guān)鍵作用；活疫苗組在末次免疫 3 周后也能檢測到 PA 抗體和芽孢抗體。不過，在高、中、低 3 個劑量范圍內(nèi)，各組間沒有顯著差異，表明候選疫苗的劑量范圍對豚鼠可能需要進(jìn)一步驗證。此外，本研究中活疫苗是采用肌內(nèi)注射，能保證進(jìn)入體內(nèi)的炭疽活芽孢數(shù)誘導(dǎo)較強(qiáng)的免疫應(yīng)答，但實際應(yīng)用中，炭疽活疫苗采用的是皮上劃痕接種，難以控制進(jìn)入人體的活芽孢數(shù)。

抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答的檢測中，ELISPOT 法在小鼠模型中大量應(yīng)用，由于豚鼠相關(guān)免疫試劑缺乏，我們選擇了淋巴細(xì)胞增殖試驗（XTT 法）和皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)試驗進(jìn)行評估。XTT 法結(jié)果顯示，rPA 和 FIS 抗原特異刺激后，高、中、低劑量組的刺激指數(shù)與氫氧化鋁佐劑組比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，這可能與該試驗方法的靈敏度有關(guān)。皮膚遲發(fā)型超敏反應(yīng)結(jié)果顯示雙組分炭疽候選疫苗和活疫苗均能誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答。

綜合考慮，rPA 抗原配伍甲醛滅活芽孢，經(jīng)氫氧化鋁凝膠吸附后制備雙組分炭疽候選疫苗，免疫豚鼠后，能誘導(dǎo)豚鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答，表明該候選疫苗具有良好的免疫原性，有望發(fā)展成新型炭疽疫苗。

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Preliminary immunological evaluation of a two-component anthrax candidate vaccine comprised of PA and Spores in Guinea pigs

LU Jin-biao, WEI Dong, WANG Guo-zhi

Division of Tuberculosis Vaccines, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

To evaluate the immune response in guinea pigs vaccinated with a two-component anthrax candidate vaccine comprised of PA and spores.

Guinea pigs were randomly divided into five groups and vaccinated with high-dose, medium-dose and low-dose candidate vaccine, anthrax live vaccine and normal saline, respectively. Serum antibody, XTT cell proliferation and DTH were detected at different times after the last vaccination.

Antibody detection indicated the two-component anthrax candidate vaccine induced strong humoral immune response. XTT proliferation test showed specific proliferation of peripheral blood lymphocytes was not obvious. However, in all candidate vaccine groups DTH conversion rate to rPA was 100% in 24 h.

The two-component anthrax candidate vaccine could induce both humoral and cellular immune response in guinea pigs.

Bacillus anthracis; Anthrax vaccines; Guinea pigs; Immunological evaluation

WANG Guo-zhi, Email: tbtestlab@163.net

“艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治”國家科技重大專項（2009ZX10004-804）

王國治，Email：tbtestlab@163.net

2012-12-09

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.008