CD44及CD44v6在不同分化程度食管癌中的表達(dá)水平

鄭淑妍 陳強(qiáng) 黃小萍 蘇少雪 林敏 劉俊斌 楊立業(yè)

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CD44及CD44v6在不同分化程度食管癌中的表達(dá)水平

鄭淑妍 陳強(qiáng) 黃小萍 蘇少雪 林敏 劉俊斌 楊立業(yè)★

目的通過免疫組化研究CD44及其變異體CD44v6在食管癌中的表達(dá)情況，探討其與食管癌的關(guān)系及臨床意義。方法收集潮州市中心醫(yī)院病理科存檔的食管癌蠟塊（所有病例術(shù)前均未接受過放、化療）。采用免疫組化PV-9000二步法（非生物素）檢測(cè)食管癌中CD44的表達(dá)共145例，CD44v6共146例。SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)于各組之間表達(dá)情況的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用多獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)：Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；各組中兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)：Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)的方法進(jìn)行比較。結(jié)果CD44及CD44v6在5例小細(xì)胞癌中均不表達(dá)0%，在鱗狀細(xì)胞癌中的陽性表達(dá)率分別為90.71% （127/140）和82.27%（116/141）。其中高分化鱗狀細(xì)胞癌組分別為100%（10/10）及88.89%（8/9），中分化組分別為98.21%（55/56）及94.74%（54/57），而低分化組則分別為83.78%（62/74）及72%（54/75）。CD44及CD44v6在鱗狀細(xì)胞癌與小細(xì)胞癌之間的表達(dá)情況均有顯著差異（均P＜0.01），在高分化組與中分化組間的表達(dá)差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），高分化組與低分化組及中分化組與低分化組間差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），分化越好，CD44及CD44v6的表達(dá)越強(qiáng)。結(jié)論CD44及CD44v6在食管癌中的表達(dá)與腫瘤的組織學(xué)分型及鱗狀細(xì)胞癌的分化程度有關(guān)，提示它們可以作為食管癌組織學(xué)分型的一個(gè)輔助標(biāo)記物及預(yù)后預(yù)測(cè)因子之一。另外，鑒于CD44及CD44v6在食管癌中的高表達(dá)率，提示其可能為食管癌干細(xì)胞的標(biāo)志物。

CD44；CD44v6；免疫組化；食管癌

中國是世界上食管癌高發(fā)區(qū)之一，其死亡率位居前列。0～74歲累積死亡率，男性為4.05%，女性為1.96%，前者為新加坡男性的2倍，后者為智利女性的3倍。中國食管癌世界標(biāo)化死亡率為23.4/10萬，占各種癌癥死亡的23.53%，僅次于胃癌居第二位。潮汕地區(qū)是中國的六大食管癌高發(fā)區(qū)之一，其中，又以汕頭南澳縣最高，食管癌標(biāo)化發(fā)病率在109/10萬，其次是揭陽和潮州的饒平地區(qū)[1]。

CD44分子與惡性腫瘤的關(guān)系是目前研究的熱點(diǎn)之一，研究領(lǐng)域包括腫瘤的發(fā)生、生長，浸潤、轉(zhuǎn)移以及早期診斷和預(yù)后等各個(gè)方面。對(duì)于惡性腫瘤的發(fā)生原因，目前普遍接受的觀點(diǎn)為癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活；近期腫瘤的發(fā)生又提出了腫瘤干細(xì)胞假說，認(rèn)為腫瘤的發(fā)生可能來源于干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化。CD44v6屬于變異型CD44（CD44v）家族成員，有研究認(rèn)為CD44v6的表達(dá)要先于抑癌基因的表達(dá)，可通過CD44v6的檢測(cè)進(jìn)行腫瘤的早期診斷[2]。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)我院收集的食管癌病理標(biāo)本及臨床資料，采用免疫組織化學(xué)的方法檢測(cè)CD44及CD44v6在食管癌中的表達(dá)情況，旨在了解CD44和CD44v6表達(dá)情況與食管癌的組織學(xué)分型和腫瘤的分化程度的關(guān)系，寄望于對(duì)食管癌的發(fā)生機(jī)制、臨床治療以及預(yù)后判斷提供有價(jià)值的信息。

1 材料和方法

1.1 材料

收集我院病理科2003～2006年間收檢的術(shù)前均未接受過放、化療的食管癌手術(shù)切除標(biāo)本組織存檔蠟塊，CD44共檢測(cè)145例，其中女性45例，男性100例；CD44v6共146例，其中女性44例，男性102例，年齡分布為22～73歲，平均年齡為55歲。

1.2 方法

1.2.1 石蠟切片

將收集蠟塊常規(guī)石蠟切片3張，裱于已經(jīng)過APES的硅化玻片上，其中1張用于HE染色，其它兩張用于免疫組化染色。

1.2.2 免疫組織化學(xué)染色

采用PV-9000二步法（非生物素）進(jìn)行免疫組化染色。CD44用淋巴結(jié)作陽性對(duì)照；CD44v6用扁桃體作陽性對(duì)照；兩者均用PBS代替一抗作陰性對(duì)照（對(duì)照片均由試劑公司提供），DAB顯色，蘇木素復(fù)染，光鏡觀察。

1.2.3 結(jié)果判斷

CD44定位于腫瘤細(xì)胞膜及漿，CD44v6陽性定位于腫瘤細(xì)胞膜，呈顯著棕黃色為陽性，根據(jù)染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)量分為：“-”、“+”、“++”、“+++”。腫瘤細(xì)胞不著色為0分；腫瘤細(xì)胞呈淺黃色為1分；腫瘤細(xì)胞呈黃色為2分；腫瘤細(xì)胞呈棕褐色為3分。腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0分；腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)6%～25%為1分；腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%為2分；腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)51%～75%為3分；腫瘤細(xì)胞陽性細(xì)胞數(shù)＞75%為4分。然后著色強(qiáng)度的得分加上著色細(xì)胞數(shù)的得分為總分，總分0～1為“-”、2～3為 “+”、4～5為“++”、6～7為“+++”。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS16.0軟件，對(duì)于各組之間表達(dá)強(qiáng)度的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用多獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)：Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；各組中兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)：Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)的方法進(jìn)行比較。

2 結(jié)果

2.1 CD44在食管鱗狀細(xì)胞癌高、中、低分化組及小細(xì)胞癌組的陽性率分別為100%、98.21%、83.78%和0%，4組間的比較，鱗狀細(xì)胞癌組CD44表達(dá)顯著高于小細(xì)胞癌組 （P=0.0001＜0.01），CD44除了在小細(xì)胞癌中全部失表達(dá)外，其余各組均有較高的表達(dá)率，而且其表達(dá)與腫瘤的分化程度有顯著的差異性（均P＜0.01）；但在高分化鱗狀細(xì)胞癌與中分化鱗狀細(xì)胞癌之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P=0.17），其它各組之間均與其分化程度有關(guān)（均P＜0.05），分化越差，表達(dá)強(qiáng)度越弱（圖1）。

2.2 CD44v6在食管鱗狀細(xì)胞癌高、中、低分化組及小細(xì)胞癌的陽性表達(dá)率分別為88.89%、94.74%、72%和0%。4組間的比較，鱗狀細(xì)胞癌組CD44v6表達(dá)顯著高于小細(xì)胞癌組（P＜0.01）；CD44v6除了在小細(xì)胞癌中全部失表達(dá)外，其余各組均有較高的表達(dá)率，而且其表達(dá)與腫瘤的分化程度有顯著的差異性（均P＜0.01），但在高分化鱗狀細(xì)胞癌與中分化鱗狀細(xì)胞癌之間的差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外（P=0.678），其它各組之間均與其分化程度有關(guān)（均P＜0.05），分化越差，表達(dá)強(qiáng)度越弱（如圖2）。

3 討論

CD44是一種分布極廣的細(xì)胞表面跨膜蛋白，屬細(xì)胞表面粘連分子，主要參與細(xì)胞-細(xì)胞及細(xì)胞-基質(zhì)之間的特異性粘連過程，介導(dǎo)淋巴細(xì)胞穿壁回到淋巴組織以及淋巴細(xì)胞和上皮細(xì)胞的相互作用；參與免疫淋巴細(xì)胞的激活和粘附過程；能與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合，與細(xì)胞的偽足形成及遷移有關(guān)；CD44可在不同的水平被調(diào)節(jié)，參與腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移。按CD44基因的外顯子表達(dá)方式不同分為組成型及V區(qū)變異型外顯子，分別用于編碼CD44s及CD44v[3]。有研究揭示它們與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)[4]，其異常表達(dá)與多種人類惡性腫瘤，如結(jié)腸癌、胃癌、黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。

但CD44及CD44v6在食管鱗癌中的表達(dá)及意義目前文獻(xiàn)報(bào)道并不一致。Wong等[6]認(rèn)為CD44的表達(dá)與食管癌轉(zhuǎn)移有關(guān)。Hori等[7]報(bào)道CD44的表達(dá)與食管癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，也有學(xué)者認(rèn)為CD44及CD44v6在食管鱗癌中的表達(dá)均與轉(zhuǎn)移有關(guān)[8～9]，但其相關(guān)性說法不一，其中Li等[8]認(rèn)為CD44及CD44v6在食管鱗癌中的表達(dá)與轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，即表達(dá)越強(qiáng)，轉(zhuǎn)移及侵襲能力越高。但也有持相反觀點(diǎn)的報(bào)道，且認(rèn)為CD44及CD44v6在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移癌中的表達(dá)明顯比對(duì)應(yīng)的原發(fā)灶弱，同時(shí)，轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的數(shù)目越多表達(dá)也越弱[9]。也有認(rèn)為CD44及CD44v6的表達(dá)與轉(zhuǎn)移無關(guān)的報(bào)道[10]。

本組食管癌實(shí)驗(yàn)結(jié)果則提示CD44及CD44v6表達(dá)水平均與食管癌的組織學(xué)分型及腫瘤分化程度有關(guān)（P＜0.01）。我們觀察到，鱗狀細(xì)胞癌的分化程度越高，CD44及CD44v6的表達(dá)越強(qiáng)，這與文獻(xiàn)[11]報(bào)道一致。本組中5例小細(xì)胞癌CD44及CD44v6全部失表達(dá)，提示這兩種類型的腫瘤組織可能起源不同。權(quán)芳等[12]也認(rèn)為小細(xì)胞癌來源于Kulchitsky型嗜銀黏膜細(xì)胞和多潛能上皮干細(xì)胞。鑒于CD44及CD44v6在食管鱗狀細(xì)胞癌和小細(xì)胞癌中表達(dá)的特點(diǎn)，我們認(rèn)為CD44及CD44v6可作為區(qū)別食管癌組織學(xué)類型及預(yù)后評(píng)估的輔助標(biāo)記物，值得進(jìn)一步研究。由于食管鱗狀細(xì)胞癌都起源于上皮，而絕大部分的食管鱗狀細(xì)胞癌都表達(dá)CD44及CD44v6，而且我們?cè)?jīng)有實(shí)驗(yàn)證實(shí)胚胎食管粘膜上皮的基底層均有CD44及CD44v6的表達(dá)[13]，而基底層恰恰是上皮的生發(fā)層，因此我們?cè)O(shè)想CD44及CD44v6可能是食管癌干細(xì)胞的標(biāo)志物。

圖1 CD44在食管癌中的表達(dá)Figure 1 The expression of CD44 in squamous carcinoma

圖2 CD44v6在食管癌中的表達(dá)Figure 2 The expression of CD44v6 in squamous carcinoma

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The expression of CD44 and CD44v6 on esophageal carcinoma in differential degree

ZHENG Shuyan, CHEN Qiang, HUANG Xiaoping, SU Shaoxue, LIN Min, LIU Junbin, YANG Liye★
(Department of Pathology, Chaozhou Central Hospital Affiliated to South Medical University, Guangdong, Chaozhou 521000, China)

ObjectiveTo explore the relationship and clinical signi fi cance through investigated the expression of CD44 and CD44v6 in esophageal carcinoma by immunohistochemical method.MethodsParaf fi n blocks of esophageal carcinoma were collected from department of Pathology, Chaozhou central hospital. The patients were not treated with chemotherapy or radiotherapy before operation. The expression of CD44 in 145 cases were detected by immunohistochemistry PV-9000 two-steps methods with monoclonal antibodies directed against speci fi c CD44. The expression of CD44v6 in 146 cases were detected by the same method. The results were analyzed with SPSS 16.0 statistics software. The difference of expression between each sample in one group was analyzed by multi-independent samples nonparameter tests (Kruskal-Wallis H tests). The difference of expression between two samples in one group was analyzed by 2-independent samples nonparameter tests (Kruskal-Wallis H tests).ResultsThe expression of CD44 and CD44v6 in fi ve cases of small cell carcinoma were all negative. In squamous cell carcinoma (SCC), the positive expression rate were 90.71% (127/140) and 82.27% (116/141) each other. Among them, the positive rate of the well-differentiated SCC were 100% (10/10) and 88.89% (8/9), respectively. The moderately differentiated SCC were 98.21% (55/56) and 94.74% (54/57), respectively. The poorly differentiated SCC were 83.78% (62/74) and 72% (54/75), respectively. There wassigni fi cant difference between SCC and small cell carcinoma for the expression of CD44 and CD44v6 (P＜0.01). There was no signi fi cant difference for the expression of CD44 and CD44v6 between well-differentiated SCC and moderately differentiated SCC (P＞0.05). But it was found that there was signi fi cant difference between well-differentiated and poorly differentiated SCC (P＜0.01). The same result was found between moderately differentiated SCC and poorly differentiated SCC too (P＜0.01). The better differentiated, the stronger CD44 and CD44v6 expressed.ConclusionThe expression of CD44 and CD44v6 in esophageal carcinoma was associated with it's histological type and the differentiation grade of SCC. It implied that CD44 and CD44v6 may be a considerable tumor maker of esophageal carcinoma histological type and the factors for prognosis. The high positive expression rate of CD44 and CD44v6 implied that they may be the markers of esophageal carcinoma stem cells.

CD44; CD44v6; Immunohistochemistry; Esophageal carcinoma

廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)技術(shù)研究基金（B2008179）；廣東省社會(huì)發(fā)展計(jì)劃（2011B031800329）

南方醫(yī)科大學(xué)附屬潮州市中心醫(yī)院，廣東，潮州 521000

★通訊作者: 楊立業(yè)，E-mail: yangleeyee@sina.com