微波輔助提取蓮霧多糖

李粉玲，蔡漢權，洪仰純

（廣東韓山師范學院，廣東 潮州 521041）

20 世紀初，由于膜的化學功能、免疫物質(zhì)的化學研究與發(fā)展以及新藥物資源的尋找與研究等，發(fā)現(xiàn)糖類在生物體中的作用不僅是作為能量資源或結(jié)構(gòu)材料，更重要的是廣泛參與細胞識別、細胞生長、分化、代謝、胚胎發(fā)育、細胞癌變、病毒感染、免疫應答等生命現(xiàn)象中細胞的各種活動，具有多種多樣的生物學功能，因此糖的研究開始逐步活躍起來。其中，一些分子量在幾千以上，具有很強生物活性的活性多糖的研究受到日益重視，它們的生理活性、化學結(jié)構(gòu)以及構(gòu)效關系成為多糖研究的前沿陣地，是現(xiàn)代醫(yī)學和食品功能化學共同關注的焦點。

多糖作為水果中的一類重要結(jié)構(gòu)物質(zhì)與功能物質(zhì)，在各種水果中均大量存在。這些多糖不僅賦予果實一定的質(zhì)構(gòu)特性和感官品質(zhì)，而且在果實病蟲害防御等方面具有重要的作用，因此常常成為水果成熟度判定、貯藏加工、品質(zhì)分析控制和病害防治研究中的一項重要指標。從2001 年來隨著天然活性多糖研究的深入，大量的水果多糖資源不斷被發(fā)掘利用，目前已報道的水果活性多糖種類達幾十種，幾乎涉及到所有常見水果種類[1]。

蓮霧（Syzygium samarangense Merr.etPerry.），又名金山蒲桃、洋蒲桃、輩霧、璉霧、爪哇蒲桃、水蒲桃等，是桃金娘科蒲桃屬熱帶常綠喬木果樹，原產(chǎn)馬來半島及安達曼群島，是著名的熱帶水果。蓮霧的用途很廣，蓮霧樹速生快長，周年常綠，樹姿優(yōu)美；花期長，花濃香，花形美麗；掛果期長，果實營養(yǎng)豐富，是營養(yǎng)全面的水果，被稱為“水果皇帝”。同時在食療上有清熱、利尿、安神、潤肺、止咳、除痰等功能，能輔助治療咳嗽、痔瘡、腹?jié)M、腸炎、痢疾、糖尿病等常見疾病[2]。文獻中對蓮霧的營養(yǎng)成分分析結(jié)果表明，蓮霧多糖含量較高[3]。本實驗將利用微波技術這一現(xiàn)代手段輔助提取蓮霧多糖。

多糖的提取方法有堿提法、水提法、微波法、酶提法和超聲波輔助提取法等。本試驗采用的是微波輔助提取法，微波萃取技術即微波輔助萃?。∕icrowavessisted extraction，MAE），是用微波能加熱與樣品相接觸的溶劑，將所需化合物從樣品基體中分離，進入溶劑中的一個過程。微波提取技術具有快速、溶劑用量少、提取率高、成本低、質(zhì)量好等優(yōu)點[4-6]。

微波提取可用于大生產(chǎn)，其安全可靠，無污染，屬于綠色工程，生產(chǎn)線組成簡單，并可節(jié)省投資。十多年來，此項技術已廣泛應用于食品、生物樣品及環(huán)境樣品的分析與提取。在多糖提取方面微波提取技術已應用于南瓜多糖、柑橘皮多糖、赤靈芝孢子多糖等的提取[7-10]。

微波萃取在用于某些生物材料的多糖提取中被證實可明顯提高提取率。張海容[11]等人以香菇多糖為研究對象，采用單因素分組實驗法對香菇多糖提取工藝（熱水法和微波提取法）進行了初步的探討，比較了時間，浸取溫度，浸取次數(shù)，液固比等因素對多糖提取率的影響。其中傳統(tǒng)熱水提取法的最佳工藝條件為：液固比10，加熱溫度45 ℃，加熱時間5 h，提取二次。微波法提取香菇多糖的最佳工藝條件：液固比10，功率40%，加熱時間180 s，PH 值1。通過兩種最佳工藝條件的結(jié)果比較可知，微波萃取法具有節(jié)能、省時、環(huán)保、操作便利且提取率高等優(yōu)點。

國內(nèi)微波能在農(nóng)業(yè)和食品加工業(yè)中應用的技術水平與國外的有一定差距，但這并不妨礙它成為一條新的物料處理的有效途徑，其發(fā)展前景十分廣闊[12]。

用苯酚-硫酸法測定多糖含量，苯酚-硫酸法顯色原理為糠醛衍生物與2-萘酚縮合生成有色物質(zhì)，在490 nm 波長處有特征吸收，測定多糖含量。多糖在硫酸存在下先水解成果糖，再衍生成具有呋喃環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物——糠醛，甲基五碳糖生成的是5-甲基五碳糠醛，六碳糖生成的是5-羧甲基糠醛。測定吸光度時所用葡萄糖標準溶液與蓮霧多糖都需現(xiàn)配現(xiàn)用才能保證結(jié)果的穩(wěn)定性及準確性，每組需平行測定3 次。用分光光度法測定蓮霧中多糖的含量，此方法簡單，準確率高。且生成的顏色持久，用苯酚-硫酸法測定多糖含量時需注意苯酚濃度不宜太高，這樣反應的穩(wěn)定性不好且易產(chǎn)生操作誤差。本實驗采用5%濃度的苯酚，測定結(jié)果較為理想。同時保持較高的硫酸濃度對多糖含量測定非常重要，因此該呈色反應是以對多糖的水解和糠醛反應為基礎的，硫酸濃度降低會影響兩種反應的進行[13-14]。

1 實驗材料、試劑與儀器

1.1 材料

蓮霧（采自潮州市）

1.2 試劑

葡萄糖標準品，95%乙醇、苯酚、濃硫酸及其他試劑均為分析純。

5.0%苯酚試劑的配制：稱取苯酚100 g，加鋁片0.1 g 和NaHCO30.05 g 蒸餾，收集182 ℃餾分。稱取7.5 g，加水150 mL 溶解，置棕色瓶內(nèi)放冰箱備用，得5.0%苯酚試劑。

葡萄糖標準溶液的配制：準確稱取干燥至恒重的葡萄糖標準品0.1 g，加適量水溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加蒸餾水至刻度搖勻，制得濃度為1 mg/mL 的葡萄糖溶液，再準確移取10 mL，用蒸餾水定容至100 mL，得0.1 mg/mL 的葡萄糖標準液。

1.3 儀器

移液管；吸量管；容量瓶；碘量瓶；離心管；試管。

FA2004N 電子天平722SP 可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；SHD-III 循環(huán)水式多用真空泵：保定高新區(qū)陽光科教儀器廠；101A-1 型電熱鼓風干燥箱：上海實驗儀器廠有限公司；冷藏冷凍箱：BCD-217YB Haier；組織搗碎機：金壇市醫(yī)療儀器廠；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-8：常州華普達教學有限公司；KDM 型調(diào)溫電熱套：山東鄄城永興儀器廠；800 型離心沉淀器：上海手術器械廠；ET-Q 型氣浴恒溫振蕩器：常州榮冠實驗分析儀器廠。

2 方法

2.1 蓮霧多糖的提取工藝

2.1.1 蓮霧的預處理

將蓮霧洗凈切碎，放在101A-1 型電熱鼓風干燥箱以60℃左右烘烤，粉碎，過40 目篩，于試劑瓶中密封備用。

2.2 多糖含量的測定

苯酚-硫酸法。

葡萄糖標準曲線制作：分別吸取葡萄糖標準液（0.1 mg/mL）0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加水稀釋至1 mL，向各管中加入5%苯酚試劑1 mL，混勻。沿管壁加入濃硫酸5 mL，靜置5 min，振搖，置沸水浴中加熱15 min，立即轉(zhuǎn)入冷水浴中冷卻至室溫。以蒸餾水為空白，在490 nm 波長處測定吸光度。以葡萄糖的含量為橫坐標，吸光值為縱坐標制作標準曲線得直線回歸方程

2.3 蓮霧多糖含量測定

取蓮霧多糖浸提液溶于適量蒸餾水中，轉(zhuǎn)移到100 mL 容量瓶中，定容。精密吸取上述溶液1.0 mL，按“標準曲線制作”項下操作，測定吸光度，根據(jù)回歸方程求出含量。

計算公式：

提取液多糖含量（mg）=c×V

式中：c 為標準曲線上查得的葡萄糖濃度，（mg/mL）；V 為蓮霧多糖溶液稀釋后的總體積，mL；W 為提取多糖時稱取的蓮霧重量，g。

3 結(jié)果與討論

3.1 葡萄糖標準曲線的制作

按照2.2 操作所得數(shù)據(jù)（如表1）制作葡萄糖標準曲線。

表1 葡萄糖標準曲線制作Table 1 The production of glucose standard curve

以吸光度A 為縱坐標，葡萄糖的濃度（mg/mL）為橫坐標，做葡萄糖標準曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 glucose standard curve

3.2 蓮霧多糖提取工藝流程

準確稱取5.00 g 蓮霧樣品于索氏提取器中用石油醚（80 ℃）回流脫脂兩次，1 h/次，每次60 mL。再用95 %乙醇回流提取兩次，1 h/次，每次60 mL。除去單糖和低聚糖，將其烘干[15]。再進行稱重，將其平均分成5 份，放入5 個碘量瓶中，按一定比例加入蒸餾水（料液比），在合適功率（微波功率）下微波浸提數(shù)秒（浸提時間），浸提結(jié)束后趁熱減壓抽濾，收集濾液。

相同條件下，再將濾渣洗入碘量瓶中二次浸提，浸提數(shù)次（浸提次數(shù)）后，合并濾液，加熱濃縮至2 mL～3 mL（原料重∶濃縮液=1∶2）。

加入4 倍體積的95℅乙醇，充分攪拌，放入冰箱中靜置2 h，在4 000 r/min 下，離心15 min。收集沉淀。沉淀物用無水乙醇洗滌，如此重復數(shù)次，直到乙醇接近無色，得到的沉淀即為粗多糖。

得到的粗多糖加50 mL 的蒸餾水使其重新溶解，加入Sevage 試劑[16-17]（正丁醇：氯仿=5∶1），振蕩15 min，靜置2 h，脫去蛋白，過濾，取其濾液，用蒸餾水溶解后定容100 mL 容量瓶中，利用苯酚-硫酸法測其吸光度A，根據(jù)回歸方程可算出多糖的含量W。

原料的微波浸提時間、微波功率、料液比以及微波浸提次數(shù)對多糖的提取結(jié)果均有影響，據(jù)以上流程，在單因素試驗的基礎上，以多糖提取量為指標進行正交試驗，確定微波萃取蓮霧多糖的最佳條件。

以提取多糖的因素為橫坐標，多糖含量（mg/g）為縱坐標做圖分析比較。

3.3 單因素實驗

3.3.1 微波浸提時間對蓮霧多糖提取的影響

將5.0 g 回流烘干的蓮霧粉末平均分成5 份于250 mL 碘量瓶中，按照料液比1∶40（g/mL）加入40 mL水，在微波功率60%（480 W）條件下分別浸提30、60、90、120、150 s，趁熱過濾，苯酚-硫酸法測定多糖的提取量，結(jié)果見圖2。

圖2 蓮霧多糖含量與微波浸提時間的關系Fig.2 Effects of microwave extraction time on the content of lotus fog polysaccharide

從圖2 看出微波加熱浸提120 s 時多糖提取量最大，浸提時間小于120 s 多糖提取不充分，浸提時間大于120 s，隨著時間的延長，多糖提取量逐漸降低，可能與較高溫度下加熱浸提時間過長導致多糖降解有關。

3.3.2 微波浸提功率對蓮霧多糖提取的影響

將5.0 g 回流烘干的蓮霧粉末平均分成5 份于250 mL 碘量瓶中，加入40 mL 蒸餾水，分別在20 %、40 %、60%、80%、100%（100%功率為800 W）功率下加熱浸提120 s，趁熱過濾，苯酚-硫酸法測定多糖含量計算提取量，結(jié)果見圖3。

圖3 蓮霧多糖含量與微波浸提功率的關系Fig.3 Effects of microwave power on the content of lotus fog polysaccharide

由圖3 看出蓮霧水溶性多糖的提取量先是隨著微波功率的增加而增大，功率80%時多糖提取量最大。隨著微波功率的加大，微波的熱效應能夠快速提升浸提液的溫度，有利于待提取物質(zhì)擴散到溶劑中，而且微波具有穿透特性使蓮霧細胞破壁，使水更容易浸入，多糖有效成分容易浸出。但當微波功率大于80%后，多糖提取量率開始降低，可能由于微波萃取功率過高，浸提液較長時間處于高溫條件下，對多糖會產(chǎn)生一定的降解作用。

3.3.3 料液比對蓮霧多糖提取的影響

將5.0 g 回流烘干的蓮霧粉末平均分成5 份于250 mL 碘量瓶中，按料液比1∶20、1∶40、1∶60、1∶80、1∶100（g∶mL）加入相應體積的水，微波功率80%（640 W），加熱浸提120 s，測定多糖提取量，結(jié)果見圖4。

圖4 蓮霧多糖含量與料液比的關系Fig.4 Effects of solid-liquid ratio on the content of lotus fog polysaccharide

從圖4 可知，當料液比 為1∶40（g∶mL）時達到最高提取量，為此，選擇料液比1∶40（g∶mL）為提取條件。

3.3.4 微波浸提次數(shù)對蓮霧多糖提取量的影響

將3.0 g 回流烘干的蓮霧粉末平均分成3 份于250 mL 碘量瓶中，根據(jù)上述試驗所得最佳浸提條件：浸提時間120 s、微波功率80%，料液比1∶40（g∶mL）、研究多糖浸提次數(shù)對多糖提取量的影響，分別浸提一至三次，結(jié)果見圖5。由圖5 可看出二次浸提時樣品液中多糖含量達到最大值，因此二次浸提為最佳的浸提次數(shù)。

圖5 蓮霧多糖含量與微波浸提次數(shù)的關系Fig.5 Effects of times on the content of lotus fog polysaccharide

3.4 正交試驗設計

在微波浸提時間、微波功率、料液比以及微波浸提次數(shù)對蓮霧多糖提取率影響單因素試驗的基礎上，進行L9（34）正交試驗，試驗設計及結(jié)果見表2、表3。

表2 正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels of orthogonal test

表3 L9（34）正交試驗設計及試驗結(jié)果Table 3 L9（34）Orthogonal experimental design and test results

表3 中極差值大小反映出影響蓮霧多糖提取率的主次因素順序為浸提次數(shù)＞微波功率＞料液比＞微波時間，經(jīng)方差分析顯示微波浸提次數(shù)和微波功率是顯著影響因素。

4 結(jié)論

4.1 實驗結(jié)果

本實驗通過三水平四因素正交試驗，確定了蓮霧多糖的最佳提取條件，即為：微波浸提時間為120 s、微波功率80%（640 W）、料液比1∶40（g∶mL），浸提次數(shù)3 次。

由于該組合未出現(xiàn)在試驗中，需要測定該條件下蓮霧多糖的提取率，經(jīng)測定，蓮霧在該條件下的提取量達到12.64 mg/g，高于正交試驗中出現(xiàn)的最高提取率，說明正交試驗確定的最佳微波萃取條件是合理的。

4.2 前景展望

近幾年來研究較多的是蓮霧的組織和規(guī)?；a(chǎn)以及分析蓮霧的營養(yǎng)成分，目前對植物多糖的提取技術有較深入的研究，而對于提取果實多糖的研究，仍處于初始研究階段，目前微波萃取技術的應用基本上還停留在實驗室小樣品的提取及分析，使用設備簡陋，工業(yè)化微波提取器尚未見報道。而對于蓮霧這種產(chǎn)量豐富，極易栽培，掛果期長的特點來說，一旦這些設備應用于大生產(chǎn)，必將對食品、香料業(yè)、傳統(tǒng)中藥制藥業(yè)等相關行業(yè)帶來巨大的革命，大大提高蓮霧的利用價值，具有一定的開發(fā)意義。

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