L.paracasei W2芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因克隆與序列分析

唐紅梅，周麗麗，張奇，邵麗麗，王立梅，*

（1.蘇州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生物科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215123；2.常熟理工學(xué)院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，蘇州市食品生物技術(shù)重點(diǎn)試驗(yàn)室，江蘇 常熟 215500）

轉(zhuǎn)氨酶是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的生物催化劑，能將α-氨基酸中的氨基轉(zhuǎn)移到α-酮酸分子上，參與許多代謝途徑，包括氨基酸的合成和分解、維生素合成、碳氮吸收、次級(jí)代謝等[1-2]。轉(zhuǎn)氨酶種類很多，其中芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶主要催化苯丙氨酸、酪氨酸、天冬氨酸和亮氨酸的氨基轉(zhuǎn)移[3]。在乳酸菌等微生物苯丙氨酸代謝途徑中，苯丙氨酸通過轉(zhuǎn)氨酶的作用形成苯丙酮酸，苯丙酮酸又可在乳酸脫氫酶作用下產(chǎn)生苯乳酸[4-5]。苯乳酸（phenyllactic acid，PLA），是一種新型天然防腐劑，有較廣的抑菌譜，能抑制細(xì)菌和真菌的污染，可延長食品的貨架期[6-8]。研究表明PLA 在較低濃度下就可有效抑制大部分食品腐敗菌，特別是其抑制真菌效果要顯著優(yōu)于一些常用食品防腐劑，如苯甲酸納、山梨酸鉀等合成防腐劑[9]，因此在食品工業(yè)中有廣闊的應(yīng)用前景。

本試驗(yàn)室篩選到一株可以產(chǎn)生苯乳酸的副干酪乳桿菌（L.paracasei W2）[10]，并對(duì)其合成苯乳酸的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化[11-12]，然而在野生菌體內(nèi)的芳香族氨基酸代謝途徑中，芳香族氨基酸生物合成受到調(diào)節(jié)機(jī)制的作用，只是合成自身代謝需要的物質(zhì)，不會(huì)大量產(chǎn)生目的產(chǎn)物苯丙氨酸，因此限制了苯丙氨酸通過轉(zhuǎn)氨反應(yīng)形成苯丙酮酸[13]，進(jìn)而限制了苯乳酸的合成，所以轉(zhuǎn)氨酶是產(chǎn)苯乳酸途徑中的一種關(guān)鍵酶[14]。

本研究從L.paracasei W2 中擴(kuò)增獲得轉(zhuǎn)氨酶基因序列（Genbank 登錄號(hào)：JX144982），通過生物信息學(xué)的方法對(duì)轉(zhuǎn)氨酶基因及其編碼的蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行全面的分析，為研究轉(zhuǎn)氨酶在副干酪乳桿菌產(chǎn)苯乳酸途徑中的生物學(xué)功能以及對(duì)其進(jìn)行分子改造從而提高苯乳酸產(chǎn)量提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與載體

副干酪乳桿菌（L.paracasei W2）：由常熟理工學(xué)院發(fā)酵工程技術(shù)研究中心分離并保存；轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞大腸桿菌JM109、克隆載體pMD19-T 購自大連寶生物公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑

LB 培養(yǎng)基用于培養(yǎng)大腸桿菌、MRS 培養(yǎng)基用于培養(yǎng)L.paracasei W2?；蚪M提取試劑盒、DNA 片段純化試劑盒、ExTaq 酶、X-gal、IPTG、Amp、DL2000 Marker均購自大連寶生物公司。引物合成，產(chǎn)物測序由上海生工完成。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)NCBI 中登錄的Lactobacillus casei str.Zhang芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物FP 和RP，擴(kuò)增轉(zhuǎn)氨酶基因。

上游引物（FP）：5’-ATGACATTAGTTGATCGGATG AATC-3’

下游引物（RP）：5’-TTAATGCGTTGCCATATACTTGG-3’

1.2.2 基因組DNA 提取及PCR 擴(kuò)增

利用基因組提取試劑盒提取L.paracasei W2 的基因組DNA，擴(kuò)增轉(zhuǎn)氨酶基因，PCR 反應(yīng)體系（50 μL）包括：10×ExTaq Buffer（Mg2+）5 μL，dNTP Mixture（各2.5 mmol/L）4 μL，上下游引物（10 μmol/L）各2 μL，基因組模板5 μL，ddH2O 31.5 μL，ExTaq 酶0.5 μL。

PCR 反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，進(jìn)行30 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后取10 μL PCR 產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠電泳中檢測結(jié)果。

1.2.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

第五，巡演類演藝。巡演類演藝指的是在整個(gè)景區(qū)內(nèi)進(jìn)行巡游演出，這種演藝節(jié)目大多都出現(xiàn)在大型游樂場等需要和游客實(shí)時(shí)互動(dòng)的旅游場合，這類演藝能調(diào)節(jié)游客在景區(qū)的心情，能營造更加強(qiáng)烈的氛圍。

利用DNA 片段純化試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，與克隆載體pMD19-T 連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ML09，篩選陽性克隆，菌落PCR 鑒定陽性重組質(zhì)粒，陽性菌株送至上海生工測序。

1.2.4 序列分析

利用生物信息學(xué)軟件對(duì)芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列進(jìn)行同源性分析，保守結(jié)構(gòu)域分析，蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)分析以及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測，例如Protparam、SOPMA、PROSITE motif search 數(shù)據(jù)庫，并用其中一些網(wǎng)站對(duì)蛋白進(jìn)行了疏水性分析、跨膜螺旋區(qū)分析和磷酸化位點(diǎn)預(yù)測等。利用swissmode1 軟件和PyMOL 軟件預(yù)測了蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。將L.paracasei W2 和其他菌種的轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)，構(gòu)建分子進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因的PCR 擴(kuò)增

以L.paracasei W2 基因組為模板，用引物FP 和RP 擴(kuò)增轉(zhuǎn)氨酶基因，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到約1.1 kb 的片段，與Lactobacillus casei str.Zhang 芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶大小一致，如圖1。

圖1 L.paracasei W2 芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因Fig.1 Aromatic Aminotransferase Gene of L.paracasei W2

2.2 重組質(zhì)粒的篩選與鑒定

將PCR 純化產(chǎn)物與pMD19-T 簡易載體連接，轉(zhuǎn)化至JM109 感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，隨機(jī)挑取白斑接種于5 mL LB（100 μg/mL Amp）的培養(yǎng)液中37 ℃、180 r/min 培養(yǎng)過夜。以菌液為模板進(jìn)行PCR，所得到的片段大小與PCR 片段大小一樣（1 164 bp），視為陽性克隆，菌液送至上海生工測序，結(jié)果如圖2。

圖2 菌落PCR 鑒定結(jié)果Fig.2 PCR identification result

2.3 轉(zhuǎn)氨酶基因序列分析

2.3.1 blast 分析結(jié)果

利用nucleotide blast 工具對(duì)轉(zhuǎn)氨酶基因序列進(jìn)行同源性分析，如圖3 所示，L.paracasei W2 的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因序列與L.casei str.zhang 相似性最高為100%，與L.casei BL23、L.casei ATCC 334、L.casei BD-II、L.casei LC2W 相似性達(dá)99%。

圖3 blastn 分析結(jié)果Fig.3 Result of blastn analyse

2.3.2 rpsblast 分析

rpsblast 分析結(jié)果如圖4，從圖中可以看出該轉(zhuǎn)氨酶有完整的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因保守結(jié)構(gòu)域，另外該基因序列還編碼天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶及天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶超家族。

圖4 預(yù)測的L.caseiW2 的Aromatic Aminotransferase 保守功能域（標(biāo)尺代表氨基酸位數(shù)）Fig.4 Prediction of conserved domain of Aromatic Aminotransferase from L.paracasei W2

2.3.3 利用EXPASY 中的ProtParam 分析芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的理化性質(zhì)

L.paracasei W2 的芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶由387 個(gè)氨基酸組成，理論分子量是41 961.2 Da，等電點(diǎn)為6.03。在組成蛋白的20 種氨基酸中，丙氨酸（Ala）所占的比例最高，達(dá)到11.9%，而色氨酸（Trp）所占的比例最低，為0.5%。該蛋白在水溶液中在280 nm 處的摩爾消光系數(shù)為36 330 M-1cm-1，0.1 %濃度時(shí)吸光系數(shù)（Abs）為0.866。其成熟N 端為甲硫氨酸時(shí)，在哺乳動(dòng)物網(wǎng)狀紅細(xì)胞體外表達(dá)的半衰期為30 h，在酵母和大腸埃希菌體內(nèi)表達(dá)的半衰期分別大于20 h 和10 h。脂肪族指數(shù)為93.10，在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為31.28。

2.3.4 信號(hào)肽、疏水性、磷酸化位點(diǎn)預(yù)測、跨膜螺旋區(qū)分析及PROSITE 分析

分析結(jié)果顯示轉(zhuǎn)氨酶沒有信號(hào)肽，疏水性較高，有8 個(gè)Ser、4 個(gè)Thr、6 個(gè)Tyr 可能成為蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)，在轉(zhuǎn)氨酶氨基酸序列的第94～112、119～137位存在兩個(gè)跨膜螺旋區(qū)。轉(zhuǎn)氨酶蛋白的功能位點(diǎn)在第233～246 位，氨基酸序列GVSKSHAMTGW RVG，其中K 為催化活性位點(diǎn)。

2.3.5 二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測

圖5 副干酪乳桿菌的轉(zhuǎn)氨酶二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.5 Seconday structure prediction of the Aminotransferase from L.paracasei W2

二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果如圖5 所示，h 為α 螺旋、e 為延伸鏈、c 為無規(guī)卷曲，轉(zhuǎn)氨酶含α 螺旋、β 折疊和無規(guī)卷曲的比例分別為44.96%、9.30%、28.94%，主要以α 螺旋為主。

利用swissmodel 軟件和PyMOL 軟件構(gòu)建出副干酪乳桿菌（L.paracasei W2）轉(zhuǎn)氨酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖6。

2.3.6 副干酪乳桿菌（L.paracasei W2）Aromatic Aminotransferase 分子進(jìn)化樹的構(gòu)建

將副干酪乳桿菌的轉(zhuǎn)氨酶與其他菌株（Escherichia coli O157：H7 str.Sakai、Lactobacillus plantarum JDM1、Lactobacillus rhamnosus GG、Lactobacillus salivarius UCC118、Lactococcus lactis subsp.lactis Il1403、Listeria monocytogenes serotype 4 b str.F2365、Proteus mirabilis HI4320、Streptococcus oralis Uo5、Lactobacillus casei str.Zhang）的芳香族轉(zhuǎn)氨酶進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)并構(gòu)建分子進(jìn)化樹，結(jié)果如圖7 所示。

圖6 L.paracasei W2 芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶高級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.6 Tertiary structure of Aromatic Aminotransferase from L.paracasei W2

圖7 副干酪乳桿菌的Aromatic Aminotransferase 的分子進(jìn)化樹Fig.7 Phylogenetic tree of Aromatic Aminotransferase from L.paracasei W2

分子進(jìn)化樹顯示在選擇的菌種中Aromatic Aminotransferase 分為兩大類，而Lactobacillus rhamnosus GG、Lactobacillus casei str.Zhang、L.paracasei W2、Lactococcus lactis subsp.Lactis Il1403、Streptococcus oralis Uo5 起源于同一個(gè)分支點(diǎn)，其中L.paracasei W2與Lactobacillus casei str.Zhang 進(jìn)化關(guān)系最近，其次與Streptococcus oralis Uo5、Lactococcus lactis subsp.Lactis Il1403 進(jìn)化關(guān)系較近。

3 結(jié)論

在乳酸菌中，苯丙氨酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下產(chǎn)生苯丙酮酸，苯丙酮酸又可在乳酸脫氫酶的作用下生成苯乳酸，轉(zhuǎn)氨作用是產(chǎn)生苯乳酸的限速步驟[15]。本試驗(yàn)擴(kuò)增得到轉(zhuǎn)氨酶基因，大小為1 164 bp，與Lactobacillus casei str.Zhang 芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶基因的相似性為100 %，證明L.paracasei W2 中確試存在此轉(zhuǎn)氨酶基因。

對(duì)轉(zhuǎn)氨酶蛋白的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)進(jìn)行分析顯示該蛋白無信號(hào)肽序列，屬于非分泌型蛋白[16]，第233 位～第246 位是蛋白的功能位點(diǎn)，氨基酸序列為GVSKSHAMTGWRVG，其中K 為輔酶磷酸吡哆醛或磷酸吡哆胺結(jié)合位點(diǎn)，輔酶起臨時(shí)的氨基載體的作用，通過輔酶在磷酸吡哆醛和磷酸吡哆胺之間的轉(zhuǎn)換來完成氨基的轉(zhuǎn)運(yùn)[17-18]。蛋白序列中有8 個(gè)Ser、4 個(gè)Thr、6 個(gè)Tyr 可能成為蛋白激酶的磷酸化位點(diǎn)。磷酸化是蛋白質(zhì)合成后廣泛存在的一種化學(xué)修飾，是控制酶活性的重要步驟，有利于從分子水平上研究轉(zhuǎn)氨酶的代謝功能[19]。通過氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)氨酶氨基酸序列中有保守的氨基酸位點(diǎn)和保守區(qū)域，是轉(zhuǎn)氨酶酶活性區(qū)域，與酶催化活性直接相關(guān)。

目前對(duì)于大腸桿菌中轉(zhuǎn)氨酶的研究有較多報(bào)道，其天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶都能催化苯丙氨酸的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)，這兩種酶分別由aspC 和tyrB基因編碼[20]。通過序列分析，L.paracasei W2 轉(zhuǎn)氨酶基因可以編碼芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，是芳香族氨基酸轉(zhuǎn)氨酶經(jīng)蛋白水解酶的作用轉(zhuǎn)變成有活性的天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，兩種酶都能催化苯丙氨酸的轉(zhuǎn)氨作用。這為我們進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)氨酶的酶學(xué)性質(zhì)以及對(duì)其進(jìn)行分子改造，從而提高L.paracasei W2 產(chǎn)苯乳酸能力提供了理論依據(jù)。

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