幾株粘細(xì)菌顯微形態(tài)特征比較

趙智穎，譚志遠(yuǎn)，朱紅惠

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東省植物分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州510642;2 廣東省微生物研究所，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省微生物應(yīng)用新技術(shù)公共實(shí)驗(yàn)室，廣東華南微生物應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室-省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，廣東 廣州510070)

粘細(xì)菌Myxobacteria 屬于變形桿菌門的變形菌門(Proteobacteria)δ 變形菌亞綱(Deltaproteobacteria)［1］，共8 個(gè)科，22 個(gè)屬，50 多個(gè)種［2-7］，是一類具有多細(xì)胞行為的革蘭陰性細(xì)菌，具有運(yùn)動(dòng)能力并可產(chǎn)生子實(shí)體和抗逆性粘孢子［8］.

粘細(xì)菌屬于原核生物，但卻具有復(fù)雜的多細(xì)胞行為和形態(tài)發(fā)生機(jī)制，并具有顯著的社會(huì)學(xué)特征［9］，是目前原核生物中已知的唯一具有多細(xì)胞行為特征的類群，被認(rèn)為是最高等的原核生物.粘細(xì)菌的細(xì)胞群體行為不但體現(xiàn)在細(xì)胞間通過(guò)信號(hào)的傳遞和感應(yīng)進(jìn)行協(xié)同攝食和運(yùn)動(dòng)，而且集中體現(xiàn)在其子實(shí)體結(jié)構(gòu)的分化發(fā)育上［10］.在營(yíng)養(yǎng)匱乏的條件下，粘細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)受協(xié)同形態(tài)建成［2］，聚集形成子實(shí)體結(jié)構(gòu).最終，60%～95%的細(xì)胞發(fā)生程序性自溶，存活的細(xì)胞有序排列，其中一部分形成沒(méi)有生殖能力的結(jié)構(gòu)細(xì)胞［10］，另一部分細(xì)胞在子實(shí)體形成末期分化成具抗逆性的粘孢子.粘孢子的形成標(biāo)志著子實(shí)體的成熟和發(fā)育過(guò)程的結(jié)束［11-12］.

除了分子鑒定，目前粘細(xì)菌的分類鑒定主要依靠粘細(xì)菌的形態(tài)特征，主要包括子實(shí)體形態(tài)、菌落特征、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子形態(tài).粘細(xì)菌的形態(tài)特征是其分類的一個(gè)重要標(biāo)準(zhǔn)，一是因?yàn)檎臣?xì)菌研究起步比較晚，粘細(xì)菌生理特征的描述只限于個(gè)別種屬，大多為粘細(xì)菌的模式菌株Myxococcus xanthus［13］;另外，粘細(xì)菌形態(tài)的復(fù)雜性意味著其形態(tài)分類比其他細(xì)菌更為可靠［2］.粘細(xì)菌依靠其形態(tài)特質(zhì)可初步鑒定到屬，進(jìn)一步的鑒定需結(jié)合分子鑒定手段.

本文通過(guò)體式顯微鏡(Stereomicroscope，SMC)、掃描電鏡(Scanning electron microscope，SEM)和透射電鏡(Transmission electricity microscope，TEM)技術(shù)，對(duì)幾株粘細(xì)菌的子實(shí)體結(jié)構(gòu)、菌落形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子形態(tài)進(jìn)行了觀察和比較.其中，使用SEM 和TEM 比傳統(tǒng)的光學(xué)顯微鏡對(duì)粘細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子能進(jìn)行更清晰的觀察和精確的測(cè)量.本研究旨在更直觀、更準(zhǔn)確地觀察、比較多株粘細(xì)菌的形態(tài)特征，為粘細(xì)菌的分類鑒定提供了更為清晰的圖片材料，從而為粘細(xì)菌分類鑒定提供一定的依據(jù).

1 材料與方法

1．1 材料

1.1.1 菌種資源 粘細(xì)菌菌株黃色粘球菌Myxoxoccus xanthus 42-lyheh-1、橙色粘球菌Myxoxoccus fulvus sp-lmz-1、葉柄粘球菌Myxoxoccus stipitatus 42-4-1、弱小珊瑚桿菌Corallococcus exiguus 42-3-1、珊瑚狀珊瑚桿菌Corallococcus coralloides 42-x1-4、大孢珊瑚球菌Corallococcus macropsporus sp-lmz-2、匣狀粘球菌Pyxidicoccus fallax 42-10-3、過(guò)渡原囊菌Archangium gephyra 42-10-1、孢囊桿菌Cystobacter minus 42-mts-2是從廣東藥用植物根系土壤中分離得到，現(xiàn)保藏于廣東省微生物菌種保藏中心.

1.1.2 主要試劑和儀器 氯化鈣、戊二醛、無(wú)水乙醇、鋨酸、叔丁醇等常規(guī)分析純?cè)噭┵?gòu)自環(huán)凱公司;瓊脂粉、放線菌酮購(gòu)于健陽(yáng)生物公司;凍干機(jī)(ES-2030);濺射儀(E-1010);體式顯微鏡(Leica M165C);掃描電鏡(日立S-3000N);透射電鏡(日立H-7650).

1．2 方法

1.2.1 SMC 觀察 粘細(xì)菌培養(yǎng)7 d 后，將培養(yǎng)物放置于體式顯微鏡的置物臺(tái)上，對(duì)其菌落形態(tài)與子實(shí)體進(jìn)行觀察并拍照.

1.2.2 SEM 觀察 對(duì)培養(yǎng)至有明顯子實(shí)體產(chǎn)生的粘細(xì)菌進(jìn)行取樣，用解剖刀切取約為0.5 cm×0.5 cm×0.1 cm 的小塊，將其置于30 g/L 的戊二醛中固定(≥5 h)，然后用pH 7.0 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液(PBS)漂洗6 次，每次20 min;10 g/L 的鋨酸處理40～60 min;PBS 漂洗4 次，每次20 min;φ 為30%和50%乙醇各漂洗2 次，每次10 min;φ 為75%和90%乙醇各漂洗1 次，每次15 min;無(wú)水乙醇漂洗3 次，每次15 min;叔丁醇置換2 次，每次20 min;置于凍干機(jī)中冷凍干燥;將處理后的樣品在體式顯微鏡下觀察并貼臺(tái);用濺射儀進(jìn)行噴金;置于掃描電鏡下觀察并拍照［14］.

1.2.3 TEM 觀察 用接種環(huán)刮取培養(yǎng)了3～7 d 的適量菌體于無(wú)菌水中，制成樣品懸液;吸取樣品懸液滴到有膜的銅網(wǎng)上，2 min 后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余的液體;滴加pH 7.0、30 g/L 的磷鎢酸于銅網(wǎng)，2 min 后用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸去多余染液;滴加純水于銅網(wǎng)，用濾紙從銅網(wǎng)邊緣吸取多余水，樣品干后電鏡觀察并拍照［15-16］.

2 結(jié)果與分析

2．1 SMC 觀察

通過(guò)SMC 觀察，可見(jiàn)粘細(xì)菌子實(shí)體顏色鮮明，大多呈亮黃色、亮橙色、鵝黃色、粉色、棕色、甚至黑色，形態(tài)多樣、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，不同種屬間子實(shí)體形態(tài)差異較大，其特征性子實(shí)體結(jié)構(gòu)可作為粘細(xì)菌分類的重要依據(jù)，各種屬自然環(huán)境下形成的子實(shí)體形態(tài)如圖1 所示.圖2 顯示了所觀察粘細(xì)菌在純培養(yǎng)狀態(tài)下形成的菌落和子實(shí)體形態(tài)，純培養(yǎng)后，部分粘細(xì)菌仍能產(chǎn)生特征性子實(shí)體，但相當(dāng)一部分種屬會(huì)隨著傳代次數(shù)的增加，子實(shí)體顏色和形態(tài)發(fā)生改變、甚至出現(xiàn)退化和消失的現(xiàn)象.其中，粘球菌屬與孢囊桿菌屬的粘細(xì)菌基本能保持較好的子實(shí)體形成能力.表1 描述了所觀察的各種屬粘細(xì)菌的主要形態(tài)特征.

圖1 自然狀態(tài)下誘導(dǎo)的多株粘細(xì)菌子實(shí)體形態(tài)圖Fig.1 Morphological characteristics of fruiting body of some myxobacteria strains

圖2 多株純培養(yǎng)粘細(xì)菌菌落及其子實(shí)體形態(tài)圖Fig.2 Morphological characteristics of colony of some myxobacteria strains

表1 分離到粘細(xì)菌各種屬的主要形態(tài)特征Tab．1 Morphological characteristics of the isolated myxobacteria strains

2．2 SEM 觀察

用SEM 對(duì)多個(gè)種屬的粘細(xì)菌子實(shí)體進(jìn)行了觀察，在適宜的條件下，大量的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生聚集并停止生長(zhǎng)，大部分細(xì)胞發(fā)生自溶，聚集的細(xì)胞發(fā)生群體的生態(tài)學(xué)發(fā)育和細(xì)胞分化，形成子實(shí)體，孢子囊內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)形態(tài)轉(zhuǎn)變生成粘孢子.子實(shí)體由一層薄的黏膜包被，孢子囊單獨(dú)或成群出現(xiàn)，形態(tài)多樣，呈圓球形、橢圓形、卷曲狀、團(tuán)狀或鏈狀(圖3).在未成熟的子實(shí)體中，可觀察到不同時(shí)期的形狀不同的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子;待子實(shí)體發(fā)育成熟后，組成子實(shí)體孢子囊的為均一的粘孢子.

圖3 多株粘細(xì)菌子實(shí)體的掃描電鏡觀察Fig.3 Scanning electron microscope observation of fruiting body of some myxobacteria strains

2．3 TEM 觀察

通過(guò)TEM 觀察，發(fā)現(xiàn)所觀察種屬粘細(xì)菌的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞均屬Ⅰ型:呈細(xì)長(zhǎng)型，末端鈍圓或稍稍變細(xì)，呈雪茄狀或針狀，長(zhǎng)度變化較大，直徑為0.5～0.8 μm，長(zhǎng)度為3.0～16.7 μm(圖4).大部分菌體中不均勻的分布著白色泡狀物，隨著時(shí)間的增加，泡狀物逐漸變大，菌體呈現(xiàn)溶解狀態(tài)，此時(shí)大部分菌體開(kāi)始自溶.粘孢子呈圓球形、橢圓形或短桿狀，有強(qiáng)烈的折光性，被一層薄的被膜包裹.圓球形或橢圓形的粘孢子，直徑為1.0～2.0 μm，短桿狀粘孢子大小為0.5～0.7 μm×1.1～2.0 μm(圖5).

圖4 多株粘細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的透射電鏡觀察Fig.4 Transmission electricity microscope observation of vegetative cells of some myxobacteria strains

圖5 多株粘細(xì)菌粘孢子的透射電鏡觀察Fig.5 Transmission electricity microscope observation of myxospore of some myxobacteria strains

3 討論與結(jié)論

以往對(duì)粘細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子形態(tài)的觀察多采用普通光學(xué)顯微鏡.比起普通光學(xué)顯微鏡，TEM 能對(duì)粘細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子的形態(tài)特征進(jìn)行更精確的觀察.普通顯微鏡分辨率為0.1～0.2 μm，放大倍數(shù)為1 000 倍，由于分辨率和放大倍數(shù)的局限［17］，只能粗略的觀察粘細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子的形狀，對(duì)粘細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子的長(zhǎng)度和大小，也只能做粗略的測(cè)量.而TEM 分辨率可達(dá)0.1～0.2 nm，放大倍數(shù)可達(dá)60～100 萬(wàn)倍，能準(zhǔn)確區(qū)分營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的形狀為針形、船形或是雪茄形，末端是鈍圓或細(xì)長(zhǎng);能準(zhǔn)確的測(cè)量營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度;能觀察到營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的自溶現(xiàn)象;能夠清晰辨別粘孢子是圓球形或是橢球形;能觀察到粘孢子外部的包膜結(jié)構(gòu).粘細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子形態(tài)結(jié)合粘細(xì)菌的特征性子實(shí)體結(jié)構(gòu)可以將粘細(xì)菌鑒定到屬，但種與種之間的鑒定仍需要結(jié)合分子鑒定手段.

粘細(xì)菌子實(shí)體的特征性結(jié)構(gòu)是粘細(xì)菌分類的最重要的指標(biāo)，一般用SMC 進(jìn)行觀察，但SMC 放大倍數(shù)有限，僅能夠用于子實(shí)體外部形態(tài)和大小的觀察，而SEM 分辨率可達(dá)0.5～1.0 nm，放大倍數(shù)可達(dá)20～30 萬(wàn)倍，不僅可以對(duì)其特征性結(jié)構(gòu)進(jìn)行準(zhǔn)確的描述，還可對(duì)子實(shí)體結(jié)構(gòu)進(jìn)行精確的區(qū)分:不具有繁殖能力的結(jié)構(gòu)部分，如孢子囊壁、囊柄等;具有繁殖能力的孢子囊部分，其內(nèi)包含了成熟的粘孢子.另外，SEM 不僅能觀察粘細(xì)菌子實(shí)體的形態(tài)特征，還能觀察到子實(shí)體形成過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞有序聚集、定向爬行運(yùn)動(dòng)和營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)變化過(guò)程.

從土壤樣品中分離得到的粘細(xì)菌，常常會(huì)因培養(yǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或傳代次數(shù)太多而引起子實(shí)體的退化，甚至喪失形成子實(shí)體的能力.因而在分離得到粘細(xì)菌后，應(yīng)及時(shí)對(duì)其子實(shí)體形態(tài)進(jìn)行觀察，并選取傳代次數(shù)較少的粘細(xì)菌進(jìn)行其子實(shí)體的掃描電鏡觀察，以免錯(cuò)失觀察粘細(xì)菌各種屬特征性子實(shí)體的最佳時(shí)間.在培養(yǎng)粘細(xì)菌時(shí)，應(yīng)選取適當(dāng)?shù)沫傊|(zhì)量濃度，質(zhì)量濃度在15 g/L 為宜.培養(yǎng)基太軟，在掃描電鏡制樣時(shí)，會(huì)增加用手術(shù)刀切取樣品的難度;培養(yǎng)基太硬，粘細(xì)菌則難以生長(zhǎng)，且培養(yǎng)基容易在培養(yǎng)過(guò)程中脫水，阻礙粘細(xì)菌的正常生長(zhǎng)［18］.在透射電鏡的制樣過(guò)程中，若樣品懸液中雜質(zhì)太多，如大量的細(xì)胞碎片、培養(yǎng)基殘?jiān)?、糖類以及各類鹽類結(jié)晶的存在都會(huì)干擾染色反應(yīng)和電鏡的觀察［19］;尤其是糖類在電子束的轟擊下，容易碳化而有礙于觀察;由于粘細(xì)菌胞外多糖豐富，因此需減少磷鎢酸處理的時(shí)間，避免樣品在觀察時(shí)顏色太黑，影響觀察結(jié)果［20］.

本試驗(yàn)利用從廣東藥用植物根際土壤分離得到的多個(gè)種屬粘細(xì)菌，通過(guò)SMC、SEM 和TEM 3 種觀察技術(shù)，對(duì)其子實(shí)體結(jié)構(gòu)、菌落形態(tài)、營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞和粘孢子形態(tài)進(jìn)行了觀察和比較，對(duì)多個(gè)種屬粘細(xì)菌的顯微形態(tài)特征進(jìn)行了詳細(xì)的描述，為粘細(xì)菌分類鑒定提供了圖片材料和理論基礎(chǔ).

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