烤煙種質(zhì)資源形態(tài)學(xué)標(biāo)記及SSR標(biāo)記的多樣性研究

陳 杰，楊 靜，陳建軍，趙偉才，蔡一霞，鄧世媛，王 維

(1 華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，廣東 廣州510642;2 貴州省黔東南州煙草公司，貴州 凱里556000;3 廣東省煙草南雄科學(xué)研究所，廣東 南雄512400)

煙草Nicotiana tabacum 屬茄科Solanaceae 煙草屬Nicotiana，是我國(guó)乃至全世界最重要的經(jīng)濟(jì)作物之一．煙草品種是煙葉生產(chǎn)的基礎(chǔ)，通過(guò)改良品種提高煙葉質(zhì)量，以滿足卷煙工業(yè)的要求，是一條投資少、收益高的最佳途徑［1］．近年來(lái)，在煙草育種中過(guò)度使用主體親本，尤其是我國(guó)煙草育種以NC89、G28、K326 等優(yōu)質(zhì)品種作為中心品種進(jìn)行煙草育種，育種目標(biāo)單一，使得育成品種遺傳背景相似、品種單一化現(xiàn)象嚴(yán)重［2-3］．育種中心品種的選擇范圍較狹窄，育成的品種往往具有比較相同的優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)病害的抗感性也基本一致，一旦病害大面積發(fā)生，對(duì)煙葉生產(chǎn)會(huì)造成不利影響．大多數(shù)煙區(qū)品種單一化問(wèn)題較為突出，急需新品種，但現(xiàn)在可供選擇的品種較少，無(wú)法滿足生產(chǎn)的要求［4］．因此，煙葉生產(chǎn)迫切要求育種工作者更多、更快、更好地推出新品種．遺傳多樣性是生物多樣性研究的核心，它反映出物種的遺傳背景、育種潛力和利用價(jià)值，對(duì)煙草種質(zhì)遺傳多樣性及不同煙草類型間的遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，對(duì)充分發(fā)掘利用現(xiàn)有種質(zhì)、合理選配親本、拓寬育成品種遺傳基礎(chǔ)和保護(hù)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)具有十分的重要意義［5］．近年來(lái)，利用DNA 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)煙草種質(zhì)資源遺傳多樣性開(kāi)展了大量的研究［6-16］，并由單一的分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)展到多種分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)同一供試材料進(jìn)行親緣關(guān)系的研究［17-20］，均得出煙草種間遺傳多樣性較豐富、普通煙草栽培種內(nèi)親緣關(guān)系較近的結(jié)論．利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記和分子標(biāo)記2 種標(biāo)記結(jié)合的方法對(duì)種質(zhì)材料進(jìn)行多態(tài)性分析并不多見(jiàn)［21-22］，在煙草種質(zhì)遺傳多樣性的分析中鮮見(jiàn)相關(guān)報(bào)道．

煙草作為重要的經(jīng)濟(jì)作物，葉片是其收獲器官，現(xiàn)蕾期的形態(tài)學(xué)性狀作為衡量煙草產(chǎn)量和品質(zhì)的一個(gè)重要參考依據(jù)，現(xiàn)蕾天數(shù)影響到著生葉片數(shù)，而葉片數(shù)直接控制著產(chǎn)量的高低．田間雜交育種對(duì)親本的選擇不僅要看其親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近更要看其在當(dāng)?shù)貧夂驐l件下的表型特征及抗逆性，并于現(xiàn)蕾期選擇生長(zhǎng)健壯、性狀優(yōu)良的煙株進(jìn)行留種，待開(kāi)花進(jìn)行雜交．因此煙草現(xiàn)蕾期形態(tài)學(xué)性狀的考察對(duì)雜交育種工作的順利開(kāi)展具有十分重要的意義．本文以烤煙現(xiàn)蕾期的形態(tài)指標(biāo)作為形態(tài)學(xué)標(biāo)記，結(jié)合SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)69份烤煙種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳多態(tài)性分析，試圖為烤煙田間育種中優(yōu)良品種、品系的選育，尤其是烤煙早花育種中對(duì)抗早花育種材料的直觀選擇提供依據(jù)，最大限度地挖掘利用現(xiàn)有種質(zhì)資源．

1 材料與方法

1．1 材料

參試烤煙種質(zhì)69 份，由廣東省煙草南雄科學(xué)研究所提供．材料名稱及來(lái)源見(jiàn)表1．

SSR 引物信息來(lái)自Bindler 等［23］公開(kāi)發(fā)表的煙草SSR 連續(xù)圖譜及其引物序列，在各條染色體上均勻選取2～3 對(duì)(共42 對(duì))SSR 引物用于遺傳多樣性檢測(cè)．序列由生工生物工程(上海)有限公司合成;Taq DNA Polymerase 和dNTPs 均購(gòu)自新標(biāo)科信生物科技(北京)有限公司．

1．2 方法

1．2．1 形態(tài)學(xué)性狀調(diào)查 煙草成苗移栽，各個(gè)材料種植3 個(gè)小區(qū)，每小區(qū)10 株，株距為0.6 m，行距為1.2 m．記錄移栽至現(xiàn)蕾天數(shù)，調(diào)查農(nóng)藝性狀包括著生葉片數(shù)、株高、最大葉長(zhǎng)和最大葉寬，按《煙草種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》［24］調(diào)查數(shù)據(jù)．

1．2．2 DNA 提取 按上海植物生理研究所的TPS抽提法稍加修改進(jìn)行．具體過(guò)程如下:剪取新鮮葉片1 g 左右，放入2 mL 離心管中，加入液氮，迅速搗碎，加入800 μL 預(yù)熱的TPS 抽提液［100 mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)，10 mmol/L EDTA(pH 8.0)，1.0 mol/L KCl］，75 ℃水浴30 min，12 000 r/min 離心15 min，取上清液，加入2/3 體積的苯酚/三氯甲烷/異戊醇(體積比25∶24∶1)溶液，搖動(dòng)數(shù)分鐘，12 000 r/min 離心10 min，取上清液，加入2 倍體積的無(wú)水乙醇，－20 ℃放置30 min，12 000 r/min 離心10 min，倒掉上清液，用φ(乙醇)為70%的溶液洗2 次，風(fēng)干，溶于200 μL 0.5×TE 溶液中，－4 ℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1．2．3 SSR-PCR 反應(yīng)條件 PCR 反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系中含1×PCR Buffer，dNTPs 0.2 mmol·L－1，1.5 U Taq 酶，0.2 μmol·L－1引物，20 ng 模板DNA．PCR擴(kuò)增在Eppendorf mastercycler gradient 22331 hamburg上進(jìn)行，先在94 ℃下預(yù)變性3 min;再進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)的變性(94 ℃50 s)、退火(55 ℃45 s)、延伸(72℃1 min)步驟;然后在72 ℃下繼續(xù)延伸5 min;最后慢慢冷卻至10 ℃保持．

1．2．4 電泳及檢測(cè) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物加1/6 體積的上樣緩沖液，取3 μL 利用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6%聚丙烯酰胺(PAGE)凝膠電泳分離，5 V/cm 恒壓進(jìn)行電泳，電泳后，拆下膠板，蒸餾水中漂洗2 次，顯影，待條帶出現(xiàn)，拍照記錄．

1．2．5 表型數(shù)據(jù)分析 利用DPS 6.55(Data processing system)軟件對(duì)形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行基本分析，計(jì)算廣義遺傳率，進(jìn)行主成分分析．對(duì)農(nóng)藝性狀進(jìn)行Q型聚類分析，采用效果較好的類平均法(Unweigted pair-group method using arithmetic averages，UPGMA)進(jìn)行聚類，繪出聚類樹(shù)形圖．根據(jù)聚類結(jié)果，以類群結(jié)合的水平為縱坐標(biāo)，結(jié)合次數(shù)為橫坐標(biāo)，將全部聚合過(guò)程畫(huà)成一條階梯式的折線圖(聚合結(jié)合線)，用于確定一條分類等級(jí)的劃分界限．

1．2．6 基因型數(shù)據(jù)分析 擴(kuò)增產(chǎn)物按同一遷移位置的條帶在各材料中有(記為1)或無(wú)(記為0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)．利用NTSYS-pc Version 2.10e 軟件包計(jì)算遺傳相似系數(shù)，并按照UPGMA 法進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建聚類圖［25］．

表1 69 份供試烤煙品種編號(hào)及來(lái)源Tab．1 The number and origin of 69 flue-cured tobacco varieties studied in the experiment

2 結(jié)果與分析

2．1 形態(tài)學(xué)性狀分析

對(duì)烤煙農(nóng)藝性狀指標(biāo)分析(表2)可知，參試品種的各個(gè)指標(biāo)都具有廣泛的變異，各個(gè)指標(biāo)的變異系數(shù)都達(dá)到了13%以上，其中以現(xiàn)蕾天數(shù)的變異系數(shù)最小，為13.1%，變異范圍為65.31～87.20 d．株高的變異系數(shù)最大，達(dá)到了36.1%，變異范圍為60.22～115.30 cm．各個(gè)指標(biāo)的廣義遺傳率較高，都達(dá)到了70% 以上，其中以現(xiàn)蕾天數(shù)最高，為87.59%，說(shuō)明對(duì)各個(gè)指標(biāo)早期進(jìn)行選擇效果較好．對(duì)現(xiàn)蕾期各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，分別計(jì)算出各個(gè)指標(biāo)的貢獻(xiàn)率，其中以現(xiàn)蕾天數(shù)的貢獻(xiàn)率最高，為75.48%，其對(duì)應(yīng)的變異系數(shù)為各指標(biāo)中最低，在各個(gè)指標(biāo)中最為穩(wěn)定，是反映品種特性、影響現(xiàn)蕾期的最主要指標(biāo)．著生葉片數(shù)的貢獻(xiàn)率在所有指標(biāo)中居第2 位，為13.40%，是影響現(xiàn)蕾期的次要指標(biāo)．

表2 烤煙種質(zhì)形態(tài)性狀分析Tab．2 The morphological characters analysis of flue-cured tobacco germplasm

2．2 SSR 標(biāo)記的遺傳多態(tài)性分析

選擇遺傳差異大的6 份煙草種質(zhì)(編號(hào)分別為4、24、31、43、57 和62)對(duì)42 對(duì)SSR 引物進(jìn)行篩選，初步篩選出15 對(duì)多態(tài)性好、重復(fù)性好的引物用于煙草種質(zhì)的SSR 分析，結(jié)果有6 對(duì)引物在所有材料中能擴(kuò)增出清晰且穩(wěn)定的多態(tài)性帶，其余9 對(duì)引物因擴(kuò)增帶模糊或多態(tài)性帶較弱而無(wú)法統(tǒng)計(jì)．6 對(duì)SSR 引物共擴(kuò)增出76 條穩(wěn)定的條帶，其中多態(tài)性條帶66 條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增11 條多態(tài)性條帶，引物的平均多態(tài)性比率為86．8%(表3)．在所用的SSR 引物中，以引物PT20485 區(qū)分69 個(gè)品種的效果最為明顯，每個(gè)品種都有其各自獨(dú)特的指紋圖譜(圖1)．即使是親緣關(guān)系很近的品種，也可根據(jù)指紋將其分開(kāi)，如1 號(hào)K399、28 號(hào)K326 和51 號(hào)RG8(RG8 由K326 和K399 雜 交 選 育 而 成)．這 說(shuō) 明SSR 標(biāo)記在烤煙遺傳資源中具有豐富的遺傳多態(tài)性，可以很好地揭示供試材料間的遺傳差異和親緣關(guān)系．

表3 篩選出的6 對(duì)SSR 引物名稱、序列及其擴(kuò)增結(jié)果Tab．3 The six screened primer pairs applied to SSR analysis

2．3 烤煙種質(zhì)資源的遺傳相似性與差異性分析

由形態(tài)學(xué)性狀數(shù)據(jù)估算出烤煙種質(zhì)材料間的遺傳距離，69 份烤煙種質(zhì)材料間的遺傳距離在0.32～7.83 之間，平均為2.80．其中，來(lái)自美國(guó)的烤煙品種Coker316(Coker139×Hicks 回交多次)與美國(guó)品種SpeightG-52(SpeightG-28×SpeightG-141)的遺傳距離最小，為0.32，相似度最高;品種Coker316 與其他各個(gè)品種的遺傳距離也較小，平均值最小，僅為1.99;南美收集的地方品種TI245 與品種Coker86(Coker258×175L)的遺傳距離最遠(yuǎn)，為7.83，與其他各個(gè)品種的遺傳距離的平均值較高，為4.99;中國(guó)烤煙品種春雷3 號(hào)(金星6007×抵字101)與其他各個(gè)品種的遺傳距離的平均值最大，達(dá)到了5.20．

由SSR 標(biāo)記數(shù)據(jù)估計(jì)烤煙種質(zhì)材料間的遺傳相似性系數(shù)，結(jié)果表明69 份材料的遺傳相似系數(shù)在0.30～0.96 之間，平均為0.70．其中來(lái)自日本的烤煙品種日本4 號(hào)與K326 的遺傳相似系數(shù)最低，為0.30;同是來(lái)自美國(guó)的烤煙品種Virginia115(Hicks×Coker139)與NC2326(9102×Hicks 與Hicks 回交3 次)之間的遺傳相似系數(shù)最高，達(dá)到了0.96，2 個(gè)品種與其他品種的遺傳相似系數(shù)也較大，平均值都較高;來(lái)自中國(guó)河南的地方品種曼光與其他各個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)的平均值最小，為0.54;同樣來(lái)自中國(guó)的烤煙品種CV088(來(lái)源不詳)與其他各個(gè)品種的遺傳相似系數(shù)的平均值最大，為0.76．

圖1 引物PT20485 對(duì)69 份烤煙品種擴(kuò)增產(chǎn)物的聚丙烯酰胺電泳圖Fig．1 Polyacrylamide gel electrophoresis profile of SSR fragments from 69 flue-cured tobacco varieties amplified with the primer PT20485

2．4 烤煙種質(zhì)資源的聚類分析

反映聚合過(guò)程的Q 型聚類結(jié)合線(Cluster combined-line)如圖2 所示．從圖2 可以看出，品種類群的聚合在縱軸上的分布是不均勻的，類群結(jié)合水平先后出現(xiàn)過(guò)幾次飛躍，這些飛躍便將類群的結(jié)合區(qū)分為不同等級(jí)，從而形成系統(tǒng)分類的等級(jí)性．選擇適當(dāng)?shù)娘w躍，取其跳躍位置的中點(diǎn)作結(jié)合線L1和L2:

圖2 Q 型聚類結(jié)合線Fig．2 Q type cluster joint line

將L1和L2分別標(biāo)在聚類結(jié)果圖(圖3)上．從圖3可以看出，L1將各個(gè)品種明細(xì)地劃分為2 大類群:A大類包括1 號(hào)、16 號(hào)、26 號(hào)、41 號(hào)等52 個(gè)品種;B 大類包括3 號(hào)、12 號(hào)、31 號(hào)、47 號(hào)等17 個(gè)品種．A 類群的各項(xiàng)性狀指標(biāo)均比B 類群要小，A 類群各個(gè)品種的平均現(xiàn)蕾天數(shù)為61.62 d，著生葉片數(shù)20.07 片，植株高度49.93 cm，最大葉長(zhǎng)48.99 cm，最大葉寬22.37 cm;B 類群各個(gè)品種的平均現(xiàn)蕾天數(shù)為76.60 d，著生葉片數(shù)27.10 片，植株高度91.73 cm，最大葉長(zhǎng)62.41 cm，最大葉寬29.59 cm．B 大類各項(xiàng)農(nóng)藝性狀指標(biāo)比A 大類分別高24.31%、35.02%、83.73%、27.38%和32.29%．

圖3 基于形態(tài)學(xué)性狀確定的遺傳距離的品種聚類圖Fig．3 Dendrogram of flue-cured tobacco cultivars based on the morphological characters

L2將69 個(gè)品種劃分為3 類:第1 類為A 大類，包括52 個(gè)品種;第2、3 大類同屬于B 大類，這2 類的劃分主要依據(jù)為著生葉片數(shù)，第2 類包括3 號(hào)、30號(hào)、34 號(hào)、47 號(hào)、60 號(hào)5 個(gè)品種，各個(gè)品種的著生葉片數(shù)都達(dá)到了30 片以上;第3 類包括5 號(hào)、12 號(hào)、24號(hào)、42 號(hào)、67 號(hào)等在內(nèi)的12 個(gè)品種，各個(gè)品種的著生葉片數(shù)都沒(méi)有超過(guò)30 片，平均值為24.59 片．結(jié)合表2 分析的各個(gè)農(nóng)藝性狀指標(biāo)的貢獻(xiàn)率來(lái)看，現(xiàn)蕾天數(shù)貢獻(xiàn)率最高，為品種類群劃分的主要依據(jù)，著生葉片數(shù)的貢獻(xiàn)率第2，為其劃分類群的次要依據(jù)，根據(jù)著生葉片數(shù)的不同將B 類群又劃分為2 大類群．

根據(jù)SSR 分子標(biāo)記估算的各品種的Jaccard 相似系數(shù)(圖4)可知，第1 等級(jí)按Jaccard 相似系數(shù)(JS1)=0.63 可將69 份材料分為2 大類:第1 大類包括1 號(hào)、3 號(hào)、10 號(hào)、38 號(hào)等66 個(gè)品種，這些品種大多具有NC82、NC89、G28、G80、K326、K346 等品質(zhì)優(yōu)良且作為育種核心種質(zhì)資源的品種的血緣關(guān)系;第2 大類包括43 號(hào)、62 號(hào)、63 號(hào)3 個(gè)品種，這3 個(gè)品種分別為來(lái)自南美、中國(guó)、日本的地方烤煙品種，來(lái)源不詳，與其他種資的遺傳相似系數(shù)較?。?/p>

第2 等級(jí)按Jaccard 相似系數(shù)(JS2)=0.67 將所有種質(zhì)資源劃分為4 大類．第1 等級(jí)劃分中的第1 大類被細(xì)分為2 大類:1)a 小類，大多為利用品質(zhì)優(yōu)良的品種通過(guò)各種育種手段改良的后代，如13 號(hào)品種NC729 為K326 與K399 的雜交后代，17 號(hào)品種云煙97 為Speight G-7×NC89 的后代;2)b 小類，大多是利用地方品種與品質(zhì)優(yōu)良品種雜交選育的后代，如31 號(hào)品種中煙90 是(單育2 號(hào)×G28)F6×(G28×凈葉黃)的后代選育而成，49 號(hào)品種SC58 由Yellow Special×(Flord301×Warne)×(400×TI448A)選育而成．第1 級(jí)劃分中的第2 大類被細(xì)分為2 大類，其中來(lái)自南美的地方品種TI245 單獨(dú)劃分為一類，來(lái)自中國(guó)和日本的地方品種劃分為一類，這可能與煙草傳入我國(guó)路線之一是由日本傳入我國(guó)東北有關(guān)［26］．

圖4 基于SSR 分子標(biāo)記確定的69 份烤煙品種遺傳相似系數(shù)的品種聚類圖Fig．4 Dendrogram of 69 flue-cured tobacco cultivars based on the SSR molecular markers

3 討論與結(jié)論

3．1 烤煙SSR 標(biāo)記的遺傳多態(tài)性

SSR 引物在煙草上的研究應(yīng)用相對(duì)較晚，2007年，Bindler 等［23］報(bào)道了煙草的微衛(wèi)星標(biāo)記遺傳圖譜，2011年Bindler 等［27］在前期工作的基礎(chǔ)上篩選出2 317 個(gè)多態(tài)性和重復(fù)性好、條帶清晰的SSR 標(biāo)記，構(gòu)建了包括2 317 個(gè)SSR 標(biāo)記、2 363 個(gè)位點(diǎn)在內(nèi)的24 個(gè)連鎖群，遺傳圖譜總遺傳長(zhǎng)度為3 267 cM、標(biāo)記間的平均距離小于1.5 cM．這是目前世界上包含標(biāo)記位點(diǎn)最廣、標(biāo)記密度最大、平均圖距最小的煙草分子連鎖圖譜．近年來(lái)SSR 分子標(biāo)記技術(shù)在煙草遺傳育種上的應(yīng)用越來(lái)越深入、廣泛［28-31］．Cossirat［32］用160 個(gè)RAPD 引物對(duì)32 個(gè)煙草品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，其中只有9 個(gè)(占5.6%)引物能夠擴(kuò)增出29 條穩(wěn)定、清晰的多態(tài)性條帶．郭金平等［33］等利用150 個(gè)RAPD 隨機(jī)引物對(duì)22 份烤煙種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，篩選出的7 個(gè)引物(占4.67%)共擴(kuò)增出條帶清晰、穩(wěn)定的38 個(gè)譜帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出5.4 條帶，多態(tài)性條帶比例為86.8%．聶瓊等［30］從22 對(duì)SSR 引物中篩選到多態(tài)性、重復(fù)性、穩(wěn)定性都較好的8 對(duì)引物，8 對(duì)引物共檢測(cè)到72 條譜帶，60 條遺傳多態(tài)性帶，多態(tài)比例83.33%．徐軍等［31］利用Bindler 等［23］公布的286 對(duì)SSR 引物中篩選出的8 對(duì)反應(yīng)穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性強(qiáng)的引物對(duì)80 份普通煙草種質(zhì)的指紋圖譜進(jìn)行分析，共擴(kuò)增出85 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，平均每對(duì)引物10.6 個(gè)．本研究通過(guò)對(duì)42 個(gè)SSR 引物的PCR 分析，有6 個(gè)引物(占14.3%)能夠在69 個(gè)烤煙品種中共擴(kuò)增出清晰、重復(fù)性好的條帶76 條，平均每個(gè)引物擴(kuò)增12.7 條，多態(tài)性比率為86.8%．由此表明，SSR 分子標(biāo)記比RAPD 更適于煙草種質(zhì)遺傳多態(tài)性研究;同時(shí)，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)具有對(duì)DNA 模版質(zhì)量要求不高、電泳結(jié)果清晰、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，使得SSR 分子標(biāo)記技術(shù)容易掌握，對(duì)種質(zhì)的多樣性研究的結(jié)果準(zhǔn)確度高，能很好的揭示其親緣關(guān)系．

3．2 烤煙品種間的遺傳多樣性和親緣關(guān)系

種質(zhì)遺傳多樣性及遺傳關(guān)系的研究對(duì)作物的雜交育種親本的合理選擇、利用具有十分重要的意義［5］．本研究中69 份烤煙種質(zhì)資源間的遺傳距離變化范圍在0.32～7.83 之間，平均值為2.80，遺傳變化范圍較大，總體遺傳距離較近．遺傳相似系數(shù)及聚類分析表明，遺傳相似系數(shù)的范圍較寬，品種間相似性較高，遺傳相似系數(shù)在0.30～0.96 之間，平均為0.70．可見(jiàn)，69 份烤煙種質(zhì)材料的遺傳多樣性較低，親緣關(guān)系較近．這與前人［32，34-38］對(duì)烤煙種質(zhì)資源多態(tài)性研究的結(jié)果基本一致．長(zhǎng)期以來(lái)，煙草育種的主體親本主要集中在從古老的Orinoco 衍生出來(lái)的Hicks、Coker139 及其衍生的K326、K346、NC82、NC89、G28 等少數(shù)優(yōu)質(zhì)種質(zhì)［39］，加之定向選擇，使得育成品種遺傳基礎(chǔ)狹窄、品種單一化現(xiàn)象極為嚴(yán)重．目前，我國(guó)大面積種植的烤煙品種K326、云煙87(云煙2 號(hào)×K326)、云煙85(云煙2 號(hào)×K326)等品種親緣關(guān)系十分相似．近年來(lái)，我國(guó)各個(gè)煙草產(chǎn)區(qū)，根據(jù)自身的氣候生態(tài)條件及其對(duì)不同風(fēng)格香型的煙草產(chǎn)品的要求，育成一批品種遺傳性狀穩(wěn)定、品質(zhì)優(yōu)良、抗性較強(qiáng)的烤煙新品種，如粵煙97(MS207×粵煙96，粵煙96 為K326 優(yōu)良變異系)、中煙100(9201×NC89多次回交)、豫煙6 號(hào)(MSK326×自育的農(nóng)大202)、湘煙3 號(hào)(MSY2206-9×82-11-7，MSY2206-9 具有MSK326 的血緣，82-11-7 由K349 與云煙87 雜交而成)等品種，這些品種在選育過(guò)程中所用的親本范圍比較狹窄，育種目標(biāo)基本一致，造成了某些基因的定向選擇，導(dǎo)致許多非育種目標(biāo)的多樣化性狀丟失．這可能是導(dǎo)致烤煙種質(zhì)遺傳多樣性較低的主要原因．

3．3 形態(tài)標(biāo)記和分子標(biāo)記

形態(tài)標(biāo)記是遺傳標(biāo)記的一種，是人們最早利用的遺傳標(biāo)記．由于其操作簡(jiǎn)單、直觀、便于觀察，長(zhǎng)期以來(lái)，物種的分類及鑒定都是以形態(tài)標(biāo)記為主要或初步的指標(biāo)．但形態(tài)學(xué)標(biāo)記的缺點(diǎn)是遺傳表達(dá)不太穩(wěn)定，易受環(huán)境及基因影響．分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來(lái)的一種最為可靠的遺傳標(biāo)記技術(shù)．分子標(biāo)記技術(shù)不受環(huán)境、季節(jié)的影響，與形態(tài)標(biāo)記相比，更適用于植物分類和遺傳多樣性研究．本試驗(yàn)利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記，根據(jù)現(xiàn)蕾期農(nóng)藝性狀指標(biāo)將69 個(gè)品種劃分為早花類型品種和晚花類型品種．利用SSR 分子標(biāo)記遺傳相似系數(shù)的聚類結(jié)果，從系譜血緣關(guān)系及地理遠(yuǎn)緣關(guān)系2 個(gè)方面較好地揭示了烤煙資源種內(nèi)的遺傳差異，將69 份種質(zhì)劃分為從古老的Orinoco 衍生出來(lái)的優(yōu)質(zhì)種質(zhì)及具有其血緣的后代、國(guó)內(nèi)外地方品種．本研究中2 種方法在類群內(nèi)劃分表現(xiàn)出的差異性較大，親緣關(guān)系較近的品種在利用形態(tài)學(xué)標(biāo)記分析中并沒(méi)有將其劃分為一類．如品種Coker319(3 號(hào))和Coker316(7 號(hào))都是從Coker139 與Hicks 的雜交后代中選育出的品種，利用SSR 標(biāo)記分析將2 個(gè)品種劃分為一類，而形態(tài)學(xué)標(biāo)記將2 個(gè)品種劃分為完全不同的2 個(gè)類群，2個(gè)品種的遺傳距離為4.14，遠(yuǎn)大于平均遺傳距離2.80．烤煙品種農(nóng)藝性狀特征受環(huán)境影響較大，同時(shí)由于烤煙品種基本是通過(guò)常規(guī)雜交選育而成，受育種目標(biāo)的影響，使育成品種之間類別的劃分已不能完全依賴于品種系譜．本研究表明，分子標(biāo)記技術(shù)為確定品種間的遺傳差異提供了可靠的檢測(cè)方法，但在烤煙育種中進(jìn)行親本選擇時(shí)不能僅從親緣關(guān)系上進(jìn)行考慮，根據(jù)育種目標(biāo)的不同也要把品種在當(dāng)?shù)貧夂驐l件下的農(nóng)藝性狀特征作為選擇依據(jù)，全面挖掘烤煙材料的育種價(jià)值．

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