新疆古墓溝墓地人發(fā)角蛋白的提取與碳、氮穩(wěn)定同位素分析

屈亞婷, 楊益民, 胡耀武*, 王昌燧

(1. 中國科學(xué)院 古脊椎動(dòng)物與古人類研究所 脊椎動(dòng)物演化與人類起源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100044; 2. 中國科學(xué)院大學(xué)人文學(xué)院 科技史與科技考古系, 北京 100049)

0 引 言

通過古代人類食物結(jié)構(gòu)的研究，可望揭示先民的生活方式、生存環(huán)境以及遷徙活動(dòng)[1?2]。其中，人骨中骨膠原的碳、氮穩(wěn)定同位素分析，可以揭示該個(gè)體10年及以上的主要食物來源，成為探索先民食物結(jié)構(gòu)的主要研究手段[3?4]。與之相似，考古遺址中特殊情況下得以保留的人發(fā)，其碳、氮同位素分析同樣可望探索其食物來源[5?6]。

毛發(fā)由毛干和毛囊組成。毛干由外到內(nèi)可分為毛小皮(包括上表皮和外表皮，由鱗片重疊而成)、皮質(zhì)和髓質(zhì)三層。毛發(fā)中的有機(jī)質(zhì)部分，主要為角蛋白(富含胱氨酸殘基和二硫鍵)。除髓質(zhì)細(xì)胞的角蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)為 β-折疊以外，毛小皮和皮質(zhì)細(xì)胞的角蛋白均為 α-螺旋。2～3股 α-螺旋的角蛋白，可組成原纖維，進(jìn)而形成細(xì)纖維，并最終形成粗纖維。大量粗纖維，再組成結(jié)構(gòu)致密的纖維束，成為皮質(zhì)的重要組成部分[7?8]。根據(jù)“我即我食(You are what you eat)”原理[1]，生物組織的化學(xué)成分，與其食物密切相關(guān)。已有研究表明，在食物被消化吸收并轉(zhuǎn)化為生物毛發(fā)角蛋白的過程中，碳同位素將發(fā)生一定程度的分餾，但分餾系數(shù)因動(dòng)物種屬不同而有所差異[9]，例如, 與食物相比，豬(Sus scrofa)毛發(fā)角蛋白 δ13C富集0.2‰[10]，沙鼠(Meriones unguienlatus)、牛(Bos Taurus)、美洲駝(Lama glama)則分別富集 1‰、2.7‰、3.5‰[11?13]。而氮同位素則隨著營養(yǎng)級(jí)的上升而發(fā)生分餾，約富集 2‰～3‰[14?17]。與骨不同，毛發(fā)可持續(xù)生長，其生長速率因生物種屬不同存在一定差異。因此，對(duì)生物毛發(fā)中角蛋白的碳、氮同位素分析，主要反映該個(gè)體短期內(nèi)的食物來源[5?6]。此外，通過對(duì)毛發(fā)角蛋白與骨膠原的碳、氮同位素比值的對(duì)比分析，還可深入探索該個(gè)體死亡前長期與短期內(nèi)食物的變遷。

目前，通過對(duì)生物毛發(fā)中角蛋白的碳、氮穩(wěn)定同位素分析，揭示該個(gè)體的食物結(jié)構(gòu)，在國際生物考古界已有不少報(bào)道。例如，5200年前冰人發(fā)的δ13C和δ15N值分別為?21.2‰和7.0‰，表明該個(gè)體死亡前的一段時(shí)間內(nèi)主要攝取C3類的植物[18]；努比亞木乃伊 X-Group(AD 350～550)的人群，其發(fā)根(?17.10‰)與發(fā)梢(?13.25‰)的 δ13C 值迥異，反映了該人群的食物存在季節(jié)性的變化[5]；冰河時(shí)期(BP 42700±1300)的猛犸象，其毛發(fā)中碳、氮穩(wěn)定同位素比值的變化與其覓食環(huán)境的季節(jié)性變遷密切相關(guān)[19]。然而，與國際生物考古研究相比，盡管我國通過人骨中的碳、氮穩(wěn)定同位素分析揭示先民食物結(jié)構(gòu)的研究業(yè)已如火如荼、方興未艾，但對(duì)毛發(fā)角蛋白的碳、氮穩(wěn)定同位素分析迄今為止尚無任何報(bào)道。

中西方文化交流重要通道的新疆地區(qū), 氣候極其干燥，出土了大量的干尸或木乃伊，這為揭示該地區(qū)人群組成、生活方式乃至中西方文化的交流提供了重要的研究材料和線索。古墓溝遺址，代表了羅布淖爾地區(qū)青銅時(shí)代土著居民的考古學(xué)文化，14C測年表明，該墓地距今3800年前后[20?21]。之前人骨中碳、氮穩(wěn)定同位素以及微量元素的分析，表明古墓溝先民以肉食為主[22?23]。為進(jìn)一步了解先民短期的食物結(jié)構(gòu)，本研究擬以新疆古墓溝墓地人發(fā)為研究對(duì)象，開展人發(fā)組織結(jié)構(gòu)的顯微分析，采用兩種方法提取人發(fā)角蛋白，并分別進(jìn)行碳、氮穩(wěn)定同位素分析。此外，還通過與骨膠原中碳、氮穩(wěn)定同位素比值的相互比較，探索該個(gè)體在不同時(shí)間內(nèi)食物來源的差異以及發(fā)與骨之間同位素分餾的可能原因。

1 材料與方法

1.1 材料的選擇

本次分析樣品取自于M5 (為約6歲小孩)中的骨骼(圖 1)和頭發(fā)(圖 2)。

圖1 古墓溝人骨樣品Fig.1 The bone sample from Gumugou cemetery

圖2 古墓溝人發(fā)樣品Fig.2 Hair samples from Gumugou cemetery

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 顯微觀察

觀察人發(fā)鱗片結(jié)構(gòu)破損狀況，可為判斷其保存狀況提供重要依據(jù)。采用光學(xué)顯微鏡(型號(hào)：Nikon ECLIPSE LV100 POL)在500倍下觀察現(xiàn)代和古代人發(fā)的表面結(jié)構(gòu)(圖3)。

圖3 現(xiàn)代人發(fā)顯微結(jié)構(gòu)(a)和古墓溝人發(fā)顯微結(jié)構(gòu)(b)Fig.3 The microstructure of modern hair (a),The microstructure of ancient hair (b)

1.2.2 蛋白質(zhì)的提取

(1)骨膠原的制備 機(jī)械去除骨骼樣品內(nèi)外表面的污染物, 稱量。4 ℃下 HCl (0.5 mol/L)浸泡，2～3 d換酸，直至無氣泡產(chǎn)生且骨變得柔軟透明。蒸餾水洗至中性，4 ℃下浸于NaOH溶液(0.125 mol/L)，再次洗至中性。加入HCl (0.001 mol/L)，70 ℃下48 h，趁熱過濾后冷凍干燥得明膠化的骨膠原。稱取骨膠原質(zhì)量，計(jì)算骨膠原的產(chǎn)率(骨膠原/骨質(zhì)量)。

(2)頭發(fā)樣品的預(yù)處理 方法一：稱取約 1 mg人發(fā)(編號(hào)為 1號(hào))，切除人發(fā)根部的毛囊。室溫下蒸餾水超聲清洗30 min，無水乙醇超聲清洗30 min，新鮮無水乙醇4 ℃下浸泡1 d，以去除人發(fā)上的油脂[18]，自然干燥。方法二：稱取約1 mg人發(fā)(編號(hào)為2號(hào))，切除人發(fā)根部的毛囊。室溫下蒸餾水超聲清洗30 min，HCl (0.125 mol/L)超聲清洗30 min，蒸餾水洗至中性。無水乙醇超聲清洗30 min，新鮮無水乙醇4 ℃下浸泡1 d，以去除人發(fā)上的油脂，自然干燥。

1.2.3 C、N含量及穩(wěn)定同位素比值的測試

取少量骨膠原或處理后的人發(fā)1、2號(hào)樣品，稱重，于Elementar Vario-Isoprime100型穩(wěn)定同位素質(zhì)譜分析儀(中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展研究所環(huán)境同位素實(shí)驗(yàn)室)上測試其C、N含量及同位素比值。測試C和N含量所用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為磺胺(Sulfanilamide)。碳、氮穩(wěn)定同位素比值分別以USGS 24標(biāo)定碳鋼瓶氣(以PDB為基準(zhǔn))和IEAE-N-1標(biāo)定氮鋼瓶氣(以AIR為基準(zhǔn))為標(biāo)準(zhǔn)，每測試10個(gè)樣品中插入 1個(gè)實(shí)驗(yàn)室自制膠原蛋白標(biāo)樣(δ13C值為(?14.7±0.15)‰, δ15N 值為(6.88±0.2)‰)。分析精度都為±0.2‰, 碳、氮同位素比值分別以 δ13C(相對(duì)V-PDB)和δ15N(相對(duì)AIR)表示, 測試結(jié)果詳見表1。

表1 骨膠原和發(fā)角蛋白的C、N含量及同位素比值Table 1 The C, N contents and isotopic data in bone collagen and hair keratin

2 結(jié)果與討論

2.1 骨和發(fā)的污染

生物體死亡之后，在長期的埋葬過程中常受到各種埋藏環(huán)境因素的影響[24?25]，可能導(dǎo)致骨(發(fā))中化學(xué)成分發(fā)生明顯變化，造成樣品的污染[26?27]，使得食物結(jié)構(gòu)的重建無從談起。因此，探索骨(發(fā))中的蛋白質(zhì)是否發(fā)生了污染是開展穩(wěn)定同位素分析的前提。

2.1.1 骨膠原的保存狀況

對(duì)于骨膠原而言，其C、N含量和C/N摩爾比，是判斷其保存的重要鑒定指標(biāo)[28]。與現(xiàn)代骨膠原的C(41%)、N(15%)含量相比[29]，古墓溝人骨膠原的C、N含量相對(duì)較高，分別為47.6%和17.3%，表明保存較為完好。一般認(rèn)為，膠原蛋白的C/N摩爾比值在2.9～3.6之間，可認(rèn)為未受污染[28]。古墓溝人骨的C/N摩爾比值為3.2，落于此范圍內(nèi)，進(jìn)一步表明該個(gè)體的骨膠原基本未受污染。

2.1.2 人發(fā)的保存狀況

通過顯微觀察，可初步了解古發(fā)的保存狀況。與現(xiàn)代人發(fā)的完整鱗片結(jié)構(gòu)(圖 3a)相比，古發(fā)的鱗片結(jié)構(gòu)已完全破壞，但發(fā)的骨架結(jié)構(gòu)較好，仍具有一定的韌性(圖 3b)。究其原因，主要是由于發(fā)毛小皮和皮質(zhì)所含的高硫蛋白受到埋藏環(huán)境中各種物理、化學(xué)以及生物因素的侵蝕被破壞, 并且毛小皮細(xì)胞之間以及毛小皮與皮質(zhì)細(xì)胞之間的細(xì)胞膜絡(luò)合物(cell membrane complex，簡稱CMC)明顯減少，最終導(dǎo)致鱗片的破損、翹起和脫落[30]。

人發(fā)角蛋白的C/N摩爾比是判斷其保存狀況的最關(guān)鍵指標(biāo)[18]。角蛋白的 C/N摩爾比值通常落于2.9～3.8之間[17]。而經(jīng)過兩種方法處理的古墓溝人發(fā)，其C/N摩爾比值皆為3.7，可視為未受污染。

另一方面，比較人發(fā)處理的兩種方法可以明顯看出，1號(hào)樣品的C(42.6%)和N(24.0%)含量，皆顯著高于2號(hào)樣品(C、N含量分別為13.3%和7.5%)，表明酸處理會(huì)使人發(fā)角蛋白中的 C、N含量降低。如前言所述，穩(wěn)定角蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)鍵中存在大量的二硫鍵，在酸性環(huán)境下很容易斷裂，使得角蛋白發(fā)生降解，產(chǎn)生水溶性的多肽或游離氨基酸[31?32]，在處理過程中很容易流失，這應(yīng)當(dāng)是造成角蛋白C、N含量下降的主要原因。

2.2 M5個(gè)體的食物結(jié)構(gòu)

圖4 同一個(gè)體骨膠原和角蛋白的δ15N-δ13C散點(diǎn)圖Fig. 4 Scatter plot of δ15N and δ13C values of bone collagen and hair keratin from the same individual

M5人發(fā)樣品1和樣品2以及骨膠原的碳、氮穩(wěn)定同位素比值關(guān)系如圖 4所示。由圖可見，樣品 1和樣品2的δ13C和δ15N值非常接近, 表明盡管對(duì)人發(fā)的處理方法有所差異，但并不影響人發(fā)角蛋白的碳、氮穩(wěn)定同位素比值。若平均樣品1和樣品2的δ13C和δ15N值，可得人發(fā)角蛋白的δ13C和δ15N值分別為?18.8‰和14.8‰。若以人發(fā)的生長速度為每天生長0.35 mm[33]計(jì)算，則M5人發(fā)(長度為8.77 cm)反映了該個(gè)體死亡前約 250 d的平均食物組成。如前言所述，骨中的δ13C和δ15N值主要反映了個(gè)體死亡前至少 10年的平均食物組成[3]。故此，通過對(duì)M5發(fā)與骨中的δ13C和δ15N值分析，即可了解其短期與長期的食物構(gòu)成。

眾所周知，C3植物的 δ13C 值為?30‰ ～ ?23‰(均值?26.5‰)，C4植物的 δ13C 值為?9‰ ～ ?16‰(均值?12.5‰)[34]。與食物的 δ13C 值相比，人(動(dòng)物)肌肉約富集1‰，骨膠原約富集5‰左右[35]。依此，從圖4可以明顯看出，發(fā)與骨的 δ13C值(分別為?18.8‰和?18.3‰)顯現(xiàn)出典型的 C3類特征，表明先民的食物主要來源于 C3類的植物抑或以 C3類植物為食的動(dòng)物。就氮同位素而言，自食物轉(zhuǎn)化為骨膠原或發(fā)角蛋白過程中，δ15N 值大約分別富集 3‰～4‰和2‰～3‰[36?37]。顯然，發(fā)與骨的高 δ15N 值(14.8‰和15.5‰)表明先民的食物中包含了大量的動(dòng)物蛋白。綜上所述，可以看出，M5個(gè)體的食物來源一直相當(dāng)穩(wěn)定，動(dòng)物蛋白在其食物中居主導(dǎo)地位。

新疆地區(qū)是中西方交流的重要通道，畜牧業(yè)一直是先民最重要的生計(jì)之一。公元前2000年初，新疆地區(qū)出現(xiàn)的小河-古墓溝文化(以小河墓地和古墓溝墓地為代表)，其人群組成主要為歐洲人種。墓地中的隨葬品，除常見的細(xì)石器鏃、銅刀、骨角器、牛羊骨骼和皮毛制品外，還存在石鐮和石磨盤(石磨棒)等農(nóng)業(yè)工具及小麥和粟等植物遺存，顯示人群的生活方式可能主要為畜牧狩獵經(jīng)濟(jì)并輔以少許農(nóng)業(yè)[21,38?41]。之前，古墓溝墓地其他10個(gè)人骨樣品的δ13C和δ15N平均值分別為(?18.2±0.2)‰和(14.4±0.52)‰，顯示該墓地的先民主要以畜牧業(yè)為生[22]。本研究中，M5發(fā)與骨中δ13C和δ15N值的對(duì)比分析進(jìn)一步證實(shí)：先民經(jīng)營畜牧業(yè)產(chǎn)生的大量動(dòng)物肉類是先民最重要的食物來源。

2.3 骨膠原與角蛋白之間的同位素分餾

當(dāng)食物被消化吸收后，因人(動(dòng)物)的不同組織所需碳源的不同，造成了不同組織與食物之間碳同位素的分餾，使之存在明顯差異。一般而言，與食物中的δ13C值相比，肌肉約富集1‰，骨膠原約富集5‰，羥磷灰石結(jié)構(gòu)碳酸根中約富集 12‰[37]，毛發(fā)角蛋白約富集0.2‰～3.5‰[10?13]。此外，動(dòng)物飼喂實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步顯示：骨膠原中的碳主要源自食物中的蛋白質(zhì)部分，而羥磷灰石的碳則來自整個(gè)食物(包括碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂類)，發(fā)角蛋白中的碳也主要源自食物中的蛋白質(zhì)部分[42?43]。

已有的研究顯示，骨膠原蛋白相對(duì)于毛發(fā)角蛋白，其 δ13C值富集 0‰～1‰，而 δ15N值富集 0‰～2‰[44?45]。在本研究中，M5骨膠原與發(fā)角蛋白均具有高δ15N值，表明該個(gè)體絕大部分的食物來自動(dòng)物蛋白。骨膠原與發(fā)角蛋白之間的 δ13C值之差僅為0.5‰，說明兩者的碳源非常相似。此外，骨膠原的δ15N值較發(fā)角蛋白僅富集0.7‰，也反映了兩者之間具有相似的氮源。故此，可以看出，當(dāng)食物以高蛋白為主時(shí)，骨與發(fā)之間碳、氮同位素的分餾效應(yīng)較小。然而，當(dāng)食物以碳水化合物為主時(shí)，骨與發(fā)之間的同位素分餾是否存在一定的規(guī)律，尚有待進(jìn)一步研究。

另一方面，骨膠原與角蛋白在δ13C和δ15N值的差異除與先民短期與長期內(nèi)食物來源的不同密切相關(guān)外，還緣于兩者不同的氨基酸組成。角蛋白由22種氨基酸組成，以胱氨酸、甘氨酸和酪氨酸為主[31,46]；骨膠原的氨基酸則主要為甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等[47]。研究表明，不同氨基酸因其代謝途徑的多源性，往往造成不同氨基酸的δ13C和δ15N值與食物相比存在不同程度上的分餾效應(yīng)[48?49]。由此可見，發(fā)與骨的蛋白之間δ13C和δ15N值的少許差異與其各種不同氨基酸組成造成的同位素分餾效應(yīng)也密切相關(guān)。

3 結(jié) 論

比較了新疆孔雀河古墓溝遺址 M5人發(fā)與現(xiàn)代人發(fā)的組織結(jié)構(gòu)，采用兩種方法提取古發(fā)中角蛋白，并對(duì)該個(gè)體骨與發(fā)中碳、氮穩(wěn)定同位素進(jìn)行了對(duì)比分析，結(jié)論如下。

(1)與現(xiàn)代人發(fā)顯微結(jié)構(gòu)相比，古墓溝人發(fā)骨架結(jié)構(gòu)保存較好。古發(fā)的C、N含量以及C/N摩爾比顯示其未受污染。角蛋白提取過程中，酸處理雖不影響碳、氮穩(wěn)定同位素比值，但會(huì)導(dǎo)致其含量明顯降低。因此，毛發(fā)角蛋白提取，不適于酸處理。

(2)角蛋白低 δ13C 值(?18.8‰)和高 δ15N 值(14.8‰)表明該個(gè)體死亡前大半年內(nèi)攝取了大量動(dòng)物蛋白。與該個(gè)體骨膠原(反映先民長期內(nèi)食譜信息)的 δ13C 值(?18.3‰)和 δ15N 值(15.5‰)相比，可以看出，該個(gè)體的食物來源一直較為穩(wěn)定，即以大量動(dòng)物蛋白為食，主要源自發(fā)達(dá)的畜牧業(yè)。

(3)盡管角蛋白與骨膠原有著不同的氨基酸組成，但兩者之間δ13C和δ15N值的細(xì)微差異可能與該個(gè)體以高蛋白為主的食物分別轉(zhuǎn)化為骨和發(fā)中蛋白的過程中，骨與發(fā)之間碳、氮同位素的分餾效應(yīng)較小有關(guān)。

綜上所述，通過對(duì)人骨中骨膠原與人發(fā)角蛋白的δ13C和δ15N的對(duì)比分析可揭示個(gè)體食物結(jié)構(gòu)的變遷。而將人發(fā)作為研究材料，無需破壞遺骸的完整性，這為在新疆地區(qū)大力開展先民的食物結(jié)構(gòu)分析奠定了基礎(chǔ)。此外，作為中西方交流重要通道的新疆地區(qū)，人口流動(dòng)極為頻繁，而通過對(duì)富含高硫蛋白的人發(fā)中的硫穩(wěn)定同位素分析[50?51]，還可為探討新疆地區(qū)的人群遷徙和人群結(jié)構(gòu)等熱點(diǎn)問題提供重要線索。

感謝中國科學(xué)院大學(xué)陳相龍、侯亮亮、王寧、司藝和李文成等研究生在本文的實(shí)驗(yàn)和文章撰寫過程中的指導(dǎo)。

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