水稻耐鹽QTL圖譜整合

馮世超，趙宏偉，王敬國，劉化龍，趙 雪，鄒德堂*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)墾科學(xué)院植物保護(hù)研究所，哈爾濱 150038；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，哈爾濱 150030）

在我國現(xiàn)有耕地中，至少有800萬hm2土地由于不當(dāng)灌溉和施肥，導(dǎo)致土壤鹽分累積而形成鹽漬化[1]，成為限制我國農(nóng)業(yè)發(fā)展重要因素。水稻是我國主要的糧食作物之一，作為粳稻主產(chǎn)區(qū)的黑龍江省，鹽堿地面積達(dá)40萬hm2。其中，黑龍江省西部地區(qū)有鹽堿土近66.7萬hm2，主要分布在大慶及齊齊哈爾南部地區(qū)，其中含鹽量超過1%的鹽土和堿土超過10萬hm2[2]。選育耐鹽水稻品種以適應(yīng)土地鹽堿化尤為重要。

與傳統(tǒng)育種相比，利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合QTL分析方法尋找與水稻耐鹽性緊密連鎖的分子標(biāo)記，并用于分子標(biāo)記輔助選育耐鹽品種，是加快育種進(jìn)程的有效途徑，同時為抗性基因的挖掘和圖位克隆奠定基礎(chǔ)。水稻耐鹽性是多基因控制的數(shù)量性狀，國內(nèi)外學(xué)者利用不同群體定位了許多與耐鹽性相關(guān)的QTLs。龔繼明等用秈稻窄葉青8號（ZYQ8）和粳稻京系17（JX17）為親本的DH群體對水稻耐鹽性進(jìn)行QTL定位，以植株存活時間為指標(biāo)，在1號染色體RG612和C131標(biāo)記之間定位一個主效QTL－Std，以及其他7個微效QTL，貢獻(xiàn)率10.2%～38.4%[3]。Lin等利用遺傳差異較大的耐鹽品種Nona Bokra和感鹽品種Koshihikari所構(gòu)建的F2∶3群體，定位到3個影響鹽脅迫幼苗存活天數(shù)的QTL，貢獻(xiàn)率為13.9%～18.0%，并在第7和第1染色體上檢測到影響莖Na+和K+濃度的主效QTL，表型貢獻(xiàn)率分別達(dá)48.5%、40.1%、40.6%和41.7%[4]。在以往研究中，QTL定位結(jié)果受群體數(shù)量及圖譜標(biāo)記密度限制，得到的QTL精度差、置信區(qū)間大，很難估計QTL的準(zhǔn)確位置及其貢獻(xiàn)率大小，制約QTL在育種工作中的進(jìn)一步應(yīng)用。Goffinet和Gerber提出的Bioercator應(yīng)用程序可將前人研究獲得的QTL映射到高密度參考圖譜上，并通過元分析方法確定真實性QTL和縮小置信區(qū)間[5]。李雪華等對不同研究者在干旱條件下定位到的與玉米抗旱性相關(guān)的181個QTL進(jìn)行整合分析，從中發(fā)掘出15個耐旱“通用QTL”[6]。吳瓊等整合控制大豆生育期的98個QTLs，發(fā)現(xiàn)9個真實QTLs和相應(yīng)的連鎖標(biāo)記[7]。

本研究對已經(jīng)定位的水稻耐鹽性QTLs進(jìn)行整合，以期發(fā)現(xiàn)真實QTLs，為水稻耐鹽性遺傳機(jī)制研究、耐鹽分子輔助育種及耐鹽基因挖掘提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水稻耐鹽性QTLs數(shù)據(jù)的選擇、收集和整理

從www.gramene.org網(wǎng)站和已發(fā)表的文獻(xiàn)收集水稻耐鹽性QTLs的定位信息。收集和整理包括作圖群體信息（群體大小、群體類型、群體名稱和作圖函數(shù)），性狀信息，QTL信息（QTL名稱、染色體位置、LOD值、貢獻(xiàn)率、置信區(qū)間和加性效應(yīng)）以及遺傳圖譜信息（標(biāo)記名稱及遺傳距離）。如果某些QTL信息沒有給出置信區(qū)間，可以根據(jù)文獻(xiàn)[8]公式推斷其95%的置信區(qū)間（見表1）。

表1 已報道的水稻耐鹽性QTLsTable 1 Reported rice QTLs conferring salt tolerance

式中，CI是QTL的置信區(qū)間，N是作圖群體的大小，R2是QTL貢獻(xiàn)率。公式（1）適用回交和F2群體，公式（2）適用RILs群體。

1.2 水稻耐鹽性QTLs的映射

計算QTL在參考圖譜上的坐標(biāo)值的數(shù)學(xué)基礎(chǔ)是齊序函數(shù)（Homothetic function）[22]，計算共有標(biāo)記間的距離，將原始圖譜上的QTL按比例映射到參考圖譜上[23]，即映射（Projection）。Biomercator 2.1軟件通過嚴(yán)格識別QTL兩側(cè)的標(biāo)記名實現(xiàn)映射，如果左右標(biāo)記其中之一不能映射，那么QTL將被舍棄。

不同QTL定位研究所用的作圖群體和分子標(biāo)記存在差異，構(gòu)建的遺傳圖譜之間相同標(biāo)記較少，在進(jìn)行QTL映射時需選擇一個高密度分子連鎖圖譜來作參考圖譜。本研究所用參考圖譜是高密度遺傳連鎖圖譜Cornell 2001，具有較高的可信度，而且與原始圖譜之間有大量共同標(biāo)記，便于圖譜整合及QTL映射的實現(xiàn)。

1.3 水稻耐鹽QTLs的元分析

元分析（又稱作整合分析、統(tǒng)合分析、薈萃分析）是將不同研究結(jié)果匯總成原始數(shù)據(jù)進(jìn)行綜合分析的統(tǒng)計方法，它可以將不同實驗相近基因組區(qū)域檢測到的QTL進(jìn)行聚類。2000年，Goffinet和Gerber開發(fā)了元分析的算法[24]。具體過程：根據(jù)n個獨(dú)立實驗中QTLs，同一區(qū)域一致性QTLs由1－、2－、3－、4－和N－QTLs 5種模型模擬決定，即以最小的AIC值來確定真實性QTL。每種模型都是根據(jù)極大似然方法并通過高斯定理給出QTLs在染色體上的最大可能排列。模型中，一致性QTL位點取決于QTL最大可能分布的平均值，QTL一致性位點的方差由下面公式估計：

AIC值取決于模擬過程，所以它的優(yōu)化使用需滿足以下條件：QTL嚴(yán)格來源于獨(dú)立實驗；QTL數(shù)量10～40個；QTL在染色體上的覆蓋區(qū)域不超過200 cM。若處理較大的染色體或一組較大的QTLs時，應(yīng)把染色體片段分割，在每個小片段上重復(fù)進(jìn)行元分析[25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 耐鹽性QTLs在水稻染色體上的分布

在BioMercator 2.1軟件tools－maps projection選項下，實現(xiàn)水稻耐鹽QTL的映射。映射結(jié)果中，有7個群體定位的119個QTLs得到映射，構(gòu)建一張水稻耐鹽QTL的一致性圖譜。從圖譜可以發(fā)現(xiàn)，耐鹽QTL在染色體上呈不均勻分布，各條染色體上都有和耐鹽相關(guān)的QTL；第1、2、3、4、5、6、8、9、11、12條染色體上分布的QTLs較多，第7和第10條染色體上分布較少；其中，第5、7、8、9、10、12條染色體上QTLs成簇分布，其他染色體上則散在分布，整合后的部分QTLs分布見圖1。

圖1 部分耐鹽QTLs在8、9、10號染色體上的分布Fig.1 Distribution of salt tolerance QTLs in 8,9 and 10 chromosome

2.2 耐鹽性QTLs的元分析

在BioMercator 2.1軟件tools－Meta－analysis選項下，進(jìn)行耐鹽QTL的元分析。結(jié)果以每次元分析中AIC值最小的模型為準(zhǔn)來確定真實QTL。因為元分析只有在成簇區(qū)中產(chǎn)生才是有意義，所以在實際操作中忽略散在分布QTL位點產(chǎn)生的結(jié)果。

由表2可知，共有14個真實QTL被發(fā)現(xiàn)，第8和第9兩條染色體上真實QTL較多。其中，在第8條染色體上，位于99.32 cM處，圖距3.46 cM的QTL被發(fā)現(xiàn)，其標(biāo)記區(qū)間為RM22998－RM23175，置信區(qū)間97.58～101.06。在第9條染色體上，位于46.1 cM處，圖距2.78 cM的QTL被發(fā)現(xiàn)，其標(biāo)記區(qū)間為RM296－RM3912，置信區(qū)間44.71～47.49。除這兩個QTLs外，在第9條染色體上還有3個圖距小于5 cM的真實QTL，分別位于63.93、81.89、85.58 cM處，標(biāo)記區(qū)間和置信區(qū)間分別是RM409－RM 24271、RM410－RM160、RM6543－RM6491 和 63.65～64.21、81.43～82.35、84.32～86.64，第 7 條染色體有一個圖距小于5 cM的真實QTL，位于144.2 cM處，標(biāo)記區(qū)間和置信區(qū)間分別為RM248－RM420和144.1～144.5。

將元分析得到的真實QTL與原始QTL信息相比較表明，元分析可以明顯縮小QTL的置信區(qū)間，如圖2所示。

表2 水稻耐鹽QTL的元分析Table 2 Meta-analysis of salt tolerance QTLs in rice

圖2 8、9、10號染色體上耐鹽QTL的元分析Fig.2 Meta-analysis of salt tolerance QTLs on 8,9 and 10 chromosome

位于第8染色體上110.09 cM處的真實QTL與原始QTL位置十分接近，但其圖距從原來的24.5 cM縮小到8.0 cM；位于第9染色體上46.1 cM處得真實QTL圖距為2.78 cM，比原始QTL圖距13.60 cM縮小10.82 cM；位于第10染色體上53.72 cM處真實QTL與原始QTL位置相同，但其圖距從原來的12.2 cM降到5.63 cM，其他染色體上的QTLs置信區(qū)間有不同程度的縮小。

3 討論

3.1 圖譜整合和元分析方法的應(yīng)用

圖譜整合把分子連鎖圖與經(jīng)典圖譜和基因組圖譜進(jìn)一步結(jié)合。在高密度圖譜構(gòu)建的基礎(chǔ)上，通過元分析可以進(jìn)一步找到真實QTL及其標(biāo)記區(qū)間，因此圖譜整合是發(fā)掘候選基因的新途徑。尤莉等將ESTs電子定位結(jié)果與玉米耐鹽性QTLs的圖譜整合，經(jīng)驗證后發(fā)現(xiàn)3個重要耐鹽性候選基因[26]。元分析方法在其他研究中已早有應(yīng)用，Guo等對抗大豆胞囊線蟲QTL進(jìn)行元分析，并得到“真實QTL”及其連鎖標(biāo)記[27]。大多數(shù)QTL定位重要性狀基因多呈數(shù)量性狀遺傳，受遺傳背景、群體大小、基因與環(huán)境互作、統(tǒng)計方法等因素影響很大，單一的一次定位中難以真實評價每個QTL所能解釋的遺傳變異，標(biāo)記的有效性較低。采用元分析方法，在整合QTL的基礎(chǔ)上，建立數(shù)學(xué)模型，可以縮小置信區(qū)間，具有較高的可信度，提高QTL定位的準(zhǔn)確度和有效性，可克服傳統(tǒng)QTL分析結(jié)果的局限性，為更好詮釋QTL奠定基礎(chǔ)[7]。

通常高密度遺傳圖譜是精細(xì)定位QTL的前提，由于作圖群體的規(guī)模過小等原因很難獲得較高密度的圖譜，造成已有圖譜分析率較低。因此，為保證元分析的準(zhǔn)確性，必須采用高密度的整合圖譜。本研究所用的參考圖譜是高密度遺傳連鎖圖譜Cornell 2001，具有較高可信度，與原始圖譜之間有大量共同標(biāo)記保證QTL位點的進(jìn)一步分析。

3.2 耐鹽性QTL圖譜整合對MAS實踐的意義

隨著數(shù)量遺傳學(xué)和分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用的發(fā)展，復(fù)雜數(shù)量性狀的遺傳行為研究成為可能。借助分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)和適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計方法可確定目標(biāo)性狀在染色體上的位置和效應(yīng)。國內(nèi)外研究者通過構(gòu)建各種類型的群體定位許多QTL的遺傳連鎖圖譜，將控制某一性狀的QTL整合到一張相對飽和的遺傳圖譜上，不僅從整體把握該性狀在染色體上的分布特征，而且通過元分析可發(fā)現(xiàn)真實QTL及其標(biāo)記區(qū)間[5]。

本研究將已公開發(fā)表的水稻苗期耐冷QTL進(jìn)行收集和整理，通過映射和元分析建立水稻耐鹽一致性圖譜，所發(fā)現(xiàn)的真實QTL標(biāo)記區(qū)間與原區(qū)間相比都明顯縮小。如第8染色體110.09 cM處發(fā)現(xiàn)的真實QTL與原始QTL相比其圖距從原來的24.5 cM縮小到8.0 cM；位于第9染色體上46.1 cM處真實QTL比原始QTL圖距縮小10.82 cM。這些真實QTL及其標(biāo)記區(qū)間為水稻耐鹽分子標(biāo)記輔助選擇奠定基礎(chǔ)。

3.3 圖譜整合的局限性

圖譜整合在快速整合QTL有效縮小置信區(qū)間的同時，也有一定的局限。圖譜整合需要應(yīng)用大量圖譜，獨(dú)立實驗定位的QTL數(shù)量及參考圖譜上標(biāo)記致密程度都影響映射的效果，所以在整合過程中存在真實QTL丟失現(xiàn)象，在本研究中第3、第4、第11條染色體上QTLs散布于染色體上，不能確定有無真實QTL。隨著QTL定位數(shù)量增加和遺傳圖譜逐漸飽和，真實QTL丟失現(xiàn)象會得到控制[28]。

不同標(biāo)記構(gòu)建的遺傳圖譜整合，實質(zhì)上就是不同標(biāo)記的相互轉(zhuǎn)換與結(jié)合?？煽紤]啟用一些能對DNA結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的標(biāo)記（如：SCAR、STS、EST等），通過對標(biāo)記片段進(jìn)行克隆和雜交實驗來實現(xiàn)片段的轉(zhuǎn)換，加強(qiáng)不同圖譜之間的聯(lián)系與整合[29]。

4 結(jié)論

本研究利用生物信息學(xué)手段，收集整理來自15個作圖群體共263個與水稻耐鹽性相關(guān)的QTLs信息。通過Biomercator2.1和共有標(biāo)記映射，將QTLs整合到參考圖譜Cornell 2001上，并通過元分析方法計算真實QTLs及其臨近標(biāo)記。得到以下結(jié)論，構(gòu)建一張水稻耐鹽QTL的一致性圖譜。水稻耐鹽QTL在第5、7、8、9、10、12條染色體上QTLs成簇分布，其他染色體上則散在或缺失分布。元分析共發(fā)現(xiàn)14個真實QTL，其中6個圖距小于5 cM的真實QTLs分別位于第7、8、9條染色體上；這些一致性位點可用于耐鹽水稻品種的分子輔助選育及耐鹽基因的圖位克隆。

[1]高繼平,林鴻宣.水稻耐鹽機(jī)理研究的重要進(jìn)展——耐鹽數(shù)最性狀基因SKC1的研究[J].生命科學(xué),2005,17(6):563－565.

[2]劉功,李銳,王連敏,等.淺談黑龍江省鹽堿地利用[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué),2007(2):108－109.

[3]龔繼明,何平,錢前,等.水稻耐鹽性QTL的定位[J].科學(xué)通報,1998(17):1847－1850.

[4]劉濤,王敬國,劉化龍,等.水稻苗期耐冷QTL的圖譜整合[J].作物雜志,2010(3):15－19.

[5]Lin H X,Zhu M Z,Yano M,et al.QTLs for Na+and K+uptake of the shoots and roots controlling rice salt tolerance[J].Theoretical and Applied Genetics,2004,108(2):253－260.

[6]Li X H,Li X H,Hao Z F,et al.Consensus map of the QTL relevant to drought tolerance of maize under drought conditions[J].Sci Agric Sin,2005,38(5):882－890.

[7]吳瓊,齊照明,劉春燕,等.基于元分析的大豆生育期QTL的整合[J].作物學(xué)報,2009,35(8):1418－1424.

[8]Andaya V C,Mackill D J.Mapping of QTLs associated with cold tolerance during the vegetative stage in rice[J].Journal of Experimental Botany,2003,54(392):2579－2585.

[9]曲英萍.水稻耐鹽堿性QTLs分析[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2007.

[10]邱生平.水稻耐鹽性的遺傳分析及耐鹽相關(guān)基因的克隆[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2005.

[11]姚明哲.太湖流域粳稻地方品種韭菜青耐鹽性的遺傳分析[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2002:69.

[12]汪斌,蘭濤,吳為人.鹽脅迫下水稻苗期Na+含量的QTL定位[J].中國水稻科學(xué),2007,21(6):585－590.

[13]楊靜.利用雙向?qū)胂灯饰鏊灸望}QTL定位的遺傳背景效應(yīng)[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2009.

[14]孫勇.水稻耐鹽QTL表達(dá)的遺傳背景與環(huán)境效應(yīng)研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2007.

[15]藏金萍.水稻抗旱,耐鹽QTL表達(dá)的遺傳背景效應(yīng)及抗旱,耐鹽的遺傳重疊研究[D].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2008.

[16]Zang J,Wang Y,Yang J,et al.Dissection of genetic overlap of salt tolerance QTLs at the seedling and tillering stages using backcross introgression lines in rice[J].Science in China.Series C,Life Sciences/Chinese Academy of Sciences,2008,51(7):583－591.

[17]周政.不同抗逆性選擇對水稻產(chǎn)量相關(guān)性狀的影響以及高產(chǎn),抗旱和耐鹽QTL的定位[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2010.

[18]陳志偉.利用一個秈粳交重組自交系群體定位水稻苗期耐鹽性QTLs[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[19]錢益亮,王輝,陳滿元,等.利用BC2F3產(chǎn)量選擇導(dǎo)入系定位水稻耐鹽QTL[J].分子植物育種,2009,7(2):224－232.

[20]Prasad S R,Bagali S P.Molecular mapping of quantitative trait loci associated with seedling tolerance to salt stress in rice(Oryza sativa L.)[J].Curr Sci,2000,78:162－164.

[21]Lin H X,Zhu M Z,Yano M,et al.QTLs for Na+and K+up take of the shoots and roots controlling rice salt tolerance[J].Tag Theoretical and Applied Genetics Theoretische and Angewandte Genetik,2004,108(2):253－260.

[22]Yamanaka N,Ninomiya S,Hoshi M.et al.An informative linkage map of soybean reveals QTLs for flowering tfrne[J].Leaflet Mophobgy and Regions of Segregation Distortion DNA Res,2001(8):61－72.

[23]Wang Y,Yao J,Zhang Z F,et al.Comparative analysis of QTL integrated mapping and statistical analysis of QTLs affecting plant height in maize[J].Chin Sci Bull,2006,51(15):1776－1786.

[24]Goffinet B,Gerber S.Quantitative trait loci:A meta－analysis[J].Genetics,2000,155(1):463－473.

[25]Arcade A,Labourdette A,Chardon F,et al.Biomercator version 2.1[M].UMR:Génétique végétale,2004.

[26]尤莉,邱法展,張祖新,等.整合玉米基因表達(dá)與遺傳分析資料發(fā)掘耐漬性候選基因[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2007,30(3):9－13.

[27]Guo B,Sleper D A,Lu P,et al.QTLs Associated with resistance to soybean cyst nematode in soybean:Meta－analysis of QTL location[J].Crop Sci,2006,46:595－602.

[28]張耿,祝麗英,陳景堂.玉米產(chǎn)量相關(guān)性狀QTL通用圖譜的構(gòu)建及功能候選基因的開發(fā)[J].華北農(nóng)學(xué)報,2008,23(6):20－27.

[29]姜振.家蠶RAPS－SSR－AFLP三種分子標(biāo)記綜合連鎖圖譜的構(gòu)建及圖譜整合[D].蘇州:蘇州大學(xué),2010.