魚腸道弧菌單克隆抗體的制備及應(yīng)用

吳曉春,鄧燈,劉慧,程順峰,張曉君

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島266109;2.淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室,江蘇連云港222005)

魚腸道弧菌單克隆抗體的制備及應(yīng)用

吳曉春1,鄧燈1,劉慧1,程順峰1,張曉君2

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島266109;2.淮海工學(xué)院江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室,江蘇連云港222005)

以魚腸道弧菌Vibrio ichthyoenteri為抗原免疫小鼠,用PEG法將小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,分別采用酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA)技術(shù)和間接免疫熒光抗體 (EFAT)技術(shù)篩選強陽性雜交瘤細胞株,亞克隆陽性細胞株,獲得5株抗魚腸道弧菌單克隆抗體 (1C6、1D8、2D7、2D10、2E3)。Western blotting分析結(jié)果顯示,單抗2D10與相對分子質(zhì)量為44 200、36 700的魚腸道弧菌蛋白發(fā)生特異性結(jié)合;用流式細胞術(shù) (FCM)檢測單抗強度,結(jié)果顯示陽性熒光比例為13.63%,陰性對照熒光比例不足1%;人工感染牙鲆試驗結(jié)果表明,運用該單抗能夠建立魚腸道弧菌的快速診斷方法。

魚腸道弧菌;單克隆抗體;制備

魚腸道弧菌Vibrio ichthyoenteri是日本學(xué)者Ishimaru等[1]首次發(fā)現(xiàn)并命名的一種新弧菌,Kim等[2]從患病牙鲆體內(nèi)分離到該菌。近年來,由魚腸道弧菌引起的疾病尤為嚴重,表現(xiàn)出較高的死亡率和較廣的流行面積,給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[3-5]。目前已有對魚腸道弧菌生物學(xué)特性、病原性及外膜蛋白等的研究報道[4-5]。單克隆抗體具有與抗原結(jié)合特異性強、生物活性單一、理化性質(zhì)相對穩(wěn)定等優(yōu)點,在水生動物細菌性疾病研究中廣泛應(yīng)用[6],已制備了愛德華氏菌Edwardsiella tarda、副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌Stenotrophomonas maltophilia、黃海希瓦氏菌Shewanella smarisflavi等的單克隆抗體[7-10]。本研究中,作者以魚腸道弧菌為抗原免疫小鼠,利用細胞融合技術(shù),獲得了抗魚腸道弧菌單克隆抗體,并進行初步應(yīng)用,旨在為建立魚腸道弧菌的快速診斷方法提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

本研究中所用菌株均由江蘇省海洋生物技術(shù)重點建設(shè)實驗室提供;Balb/C小鼠購于山東大學(xué)實驗動物中心;健康牙鲆取自山東日照某牙鲆養(yǎng)殖場。

弗氏完全佐劑 (Comeplete adjuvant)、弗氏不完全佐劑 (Incomplete adjuvant)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,AP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG、對硝基苯磷酸鹽 (pNPP-Na)、異硫氰酸熒光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記羊抗小鼠IgG、5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸BCIP、氯化硝基四氮唑藍 NBT、聚乙二醇 (Polyethylene glycol, PEG)均購自Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 抗原的制備 將魚腸道弧菌接種于液體培養(yǎng)基中,收集細菌并調(diào)整濃度為9×109CFU/mL,然后用體積分數(shù)為0.5%的福爾馬林溶液滅活,涂板,觀察無活菌即可。

1.2.2 小鼠免疫及細胞融合 將抗原與弗氏完全佐劑按等體積混合后,給Balb/C小鼠腹腔注射0.1 mL,2周后將抗原與弗式不完全佐劑等體積混合后再給Balb/C小鼠腹腔注射0.1 mL,而后每隔1周加強免疫一次,尾靜脈注射抗原0.1 mL,共兩次。最后一次免疫后3 d,取免疫小鼠脾細胞與SP2/0瘤細胞融合。以HAT選擇性培養(yǎng)基為培養(yǎng)液,將融合后的細胞于體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱 (37℃)中培養(yǎng)。

1.2.3 用酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA)法篩選雜交瘤細胞株 調(diào)整細菌濃度為1×108CFU/mL,包被酶標(biāo)板,用戊二醛固定;用質(zhì)量分數(shù)為2%的牛血清白蛋白BSA封閉;滴加細胞上清液,以免疫小鼠血清為陽性對照,骨髓瘤細胞上清為陰性對照,于37℃下孵育1 h,用PBS-T(含0.05%Tween-20)洗滌3次,每次5 min;加AP酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG (1∶3 000),于37℃下孵育1 h,再用PBS-T洗滌3次,每次5 min;加入pNPP-Na反應(yīng)20 min,加入NaOH終止反應(yīng);用酶標(biāo)儀進行測定。

1.2.4 用間接免疫熒光 (IFAT)法篩選雜交瘤細胞株 將濃度為1×108CFU/mL的菌懸液滴片用丙酮固定;加入細胞上清液,于37℃下溫育1 h,用PBS-T洗滌3次,每次5 min;加入FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶256),于37℃下溫育1 h,再用PBS-T洗滌3次,每次5 min;封片,在熒光顯微鏡下觀察。

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1.2.5 陽性細胞株的亞克隆 采用有限稀釋法進行陽性細胞株的亞克隆。打散雜交瘤細胞株,計數(shù),取100個陽性雜交瘤細胞置于10 mL培養(yǎng)液中,混勻,滴入96孔培養(yǎng)板中,每孔100 μL,于37℃下用體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng),用IFAT法檢測。

1.2.6 特異性試驗 以濃度為1×108CFU/mL的魚腸道弧菌、鰻弧菌Vibrio anguillarum、副溶血弧菌、溶藻膠弧菌 V.alginolyticus、 哈維氏弧菌V.harveyi、嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila和遲鈍愛德華氏菌包被酶標(biāo)板,以魚腸道弧菌單克隆抗體為一抗,以AP酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶3 000)作為二抗,參照上述ELISA方法進行特異性試驗。

1.2.7 Western blotting分析抗原決定簇分子量

電泳凝膠由12%的分離膠和5%的濃縮膠兩部分組成。將濃度為9×109CFU/mL的魚腸道弧菌與電泳樣品緩沖液 (0.5 mol/L Tris-HCl pH 6.8,1% SDS,1%疏基乙醇,10%甘油,0.02%溴酚藍)等體積混合,用Tris甘氨酸 (Gly)為電泳緩沖液(0.025 mol/L Tris,0.25 mol/L Gly,0.1%SDS, pH 8.3),電泳完成后,轉(zhuǎn)移到電泳轉(zhuǎn)移槽中,恒流200 mA轉(zhuǎn)移4 h。將硝酸纖維素膜 (NC膜)用2%的BSA溶液封閉,于4℃下過夜,用PBS洗滌3次,每次5 min;加入單抗后,于37℃下孵育45 min,用PBS-T洗滌3次,每次5 min;加入AP酶標(biāo)記羊抗小鼠IgG(1∶500)后,于37℃下孵育45 min,用PBS-T洗滌3次,每次5 min;加入NBT/BCIP后,于室溫下顯色。

1.2.8 用流式細胞術(shù) (Flow cytometry,FCM)檢測單抗強度 培養(yǎng)細菌,收集并調(diào)整細菌懸液至合適濃度,取菌懸液100 μL,加入抗魚腸道弧菌單克隆抗體100 μL(陰性對照為SP2/0骨髓瘤細胞上清液),于37℃下溫育1 h,用PBS-T離心洗滌3次;加入FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG(1∶256)后,于37℃下溫育1 h,用PBS-T離心洗滌3次;用流式細胞儀檢測,用WinMDI 2.9軟件進行分析。1.2.9 人工感染試驗的檢測 將健康牙鲆 (體長為15 cm左右)養(yǎng)殖于隔離的循環(huán)水箱內(nèi),水溫為18～20℃,暫養(yǎng)1周后取健康魚進行感染試驗。試驗組牙鲆腹腔注射濃度為5×108CFU/mL魚腸道弧菌懸液0.1 mL,對照組注射同劑量無菌生理鹽水,每組注射10尾。感染魚呈現(xiàn)明顯癥狀后解剖,觀察鰓、皮膚、肌肉、肝、腎等組織的病變情況,取病變組織進行細菌分離,取優(yōu)勢菌落純化,用PBS重懸,采用上述ELISA法進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 雜交瘤細胞株的建立

以魚腸道弧菌免疫Balb/C小鼠,將小鼠脾細胞與SP2/0骨髓瘤細胞融合,用2%的HAT選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng),兩周后采用ELISA法和IFAT法檢測,篩選分泌抗魚腸道弧菌抗體的強陽性雜交瘤細胞,經(jīng)3次有限稀釋法克隆,獲得5株能穩(wěn)定分泌抗魚腸道弧菌單克隆抗體的雜交瘤細胞,編號分別為1C6、1D8、2D7、2D10、2E3。

2.2 用ELISA法檢測強陽性雜交瘤

用間接ELISA法檢測融合細胞上清液中的抗體,以O(shè)D492nm≈1.0,P/N≥2.1判為陽性,其中P/N[11]的計算公式為篩選出5株強陽性雜交瘤細胞 (1C6、1D8、2D7、2D10、2E3),其OD492nm值和P/N值見表1。

2.3 用IFAT法檢測強陽性雜交瘤

熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn),陰性對照 (圖1-A)背景為黑色,不顯示綠色熒光信號;而單抗1C6、1D8、2D7、2D10、2E3視野中可見綠色熒光信號覆蓋菌體,清晰,明亮,熒光信號呈現(xiàn)綠色長弧形,且兩端鈍圓,與魚腸道弧菌形狀一致 (圖1-B)。

2.4 特異性試驗結(jié)果

單克隆抗體與魚腸道弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌、溶藻膠弧菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌7種菌株的特異性反應(yīng)結(jié)果見表2。從表2可見:5株單抗中只有2D10與魚腸道弧菌發(fā)生反應(yīng),與其他參考菌株無交叉反應(yīng),具有較好的特異性;其他4株單抗與參考菌株均有不同程度的交叉反應(yīng)。

表1 用ELISA法篩選單克隆抗體的結(jié)果Tab.1 ELISA reactivity of MAbs against Vibrio ichthyoenteri

表2 單克隆抗體特異性的ELISA檢測結(jié)果(數(shù)值為P/N值)Tab.2 The reaction of the MAbs against various bacterial species(value for P/N)

2.5 抗原決定簇分子量的分析

經(jīng)SDS-PAGE電泳后,凝膠采用考馬斯亮藍染色,結(jié)果如圖2-A所示:共顯示21條帶,染色相對較深的有6條蛋白帶。單抗2D10的Western blotting結(jié)果可見2條清晰蛋白條帶 (圖2-C),其相對分子質(zhì)量分別為44 200和36 700。

2.6 用FCM法檢測單抗強度

利用FCM法驗證單抗與抗原特異性結(jié)合時,參照林海英等[12]的方法設(shè)置1×105、1×106、1× 107、1×108CFU/mL 4個菌液濃度,結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌液濃度為1×106CFU/mL時效果最佳。以熒光強度的對數(shù) (Fluorescence,FL1-H)為橫坐標(biāo),以相對菌體的數(shù)量 (Counts)為縱坐標(biāo),在直方圖上以標(biāo)尺(Marker)劃定區(qū)域分析比例,圖3-A為陰性對照結(jié)果,M1=99%,即陰性對照中未被熒光標(biāo)記的細菌比例高達99%;圖3-B為陽性結(jié)果,M1= 86.37%,M2=13.63%,表明加入單克隆抗體的試驗組中被熒光標(biāo)記的陽性細菌比例為13.63%。

2.7 人工感染牙鲆組織中魚腸道弧菌的檢測

人工感染牙鲆第4天,感染組牙鲆出現(xiàn)發(fā)病癥狀,牙鲆腹部有充血現(xiàn)象,剖檢發(fā)現(xiàn)肝臟充血、腎臟腫脹、有少量腹水,對照組牙鲆無任何癥狀。取發(fā)病牙鲆肝臟、脾、腎、心臟、鰓等組織分離細菌并進行ELISA檢測,發(fā)現(xiàn)其肝臟、脾、腎、鰓及腹水組織的檢測結(jié)果均為陽性,對照組為陰性。

3 討論

本研究中,以魚腸道弧菌為抗原免疫小鼠,制備該菌的單克隆抗體,針對雜交瘤細胞克隆篩選時樣品多、時間緊等要求,結(jié)合ELISA技術(shù)處理簡便、檢測量大的特點[11,13],首先采用該法檢測,判定5株雜交瘤細胞株 (1C6、1D8、2D7、2D10、2E3)為陽性;隨后又采用可直觀判定結(jié)果的IFAT方法再次確認[14],鏡檢發(fā)現(xiàn)菌體呈現(xiàn)明亮的綠色熒光信號,而陰性對照無熒光信號,該結(jié)果再次證實5株雜交瘤細胞株為陽性。

為了解獲得的單克隆抗體特性,進行了特異性試驗[9],除采用弧菌屬細菌進行特異性篩選外,另選用部分水生生物常見致病菌株如嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌等,結(jié)果顯示單抗1C6、1D8、2D7、2E3等與鰻弧菌、副溶血弧菌、溶藻膠弧菌等弧菌屬參考菌株有不同程度的交叉反應(yīng),與遲鈍愛德華氏菌、嗜水氣單胞菌等反應(yīng)均為陰性。分析認為,可能是由于弧菌屬不同菌株間具有共同抗原決定簇[15-16],而與單抗1C6、1D8、2D7、2E3結(jié)合的抗原決定簇為構(gòu)象表位或線性表位,以及編碼這些共同抗原表位的基因組是否存有差異,有待今后進一步研究。本試驗中,只有單抗2D10與弧菌屬其他菌株及嗜水氣單胞菌、遲鈍愛德華氏菌等反應(yīng)均為陰性,因此,僅對單抗2D10進行了Western blotting和FCM分析。

圖1 免疫熒光法篩選陽性抗魚腸道弧菌單抗試驗結(jié)果Fig.1 The positive hybridomas reaction with MAbs by immunofluorescence assay screening

圖2 魚腸道弧菌電泳圖譜和單抗2D10免疫印跡反應(yīng)Fig.2 Analysis of MAb 2D10 against V.ichthyoenteri by Western blotting

圖3 流式分析單抗2D10熒光強度直方圖Fig.3 Detection of MAb 2D10 reaction to V.ichthyoenteri using Flowing Cytometry

一般來講,單抗只與某一特定抗原決定簇結(jié)合,即 Western blotting結(jié)果應(yīng)該出現(xiàn) 1條蛋白帶[17],本研究中單抗2D10經(jīng)反應(yīng)后,顯示2條蛋白帶,類似結(jié)果也出現(xiàn)在Sithigorngul等[18]的試驗中。Xing等[19]認為,該類現(xiàn)象是由于抗原決定簇的多態(tài)性,即多個蛋白具有一段相同或相似的氨基酸序列,攜帶共同的抗原決定簇,或者是小分子量反應(yīng)蛋白是大分子量反應(yīng)蛋白的一部分,導(dǎo)致免疫印跡過程中顯示多條蛋白帶。

流式細胞術(shù)作為一種新技術(shù),能夠快速、準(zhǔn)確、客觀地對特定群體特征進行分析,同時可避免試驗過程中人為造成的不確定性和試驗假象[20],本試驗中FCM顯示熒光比例為13.63%,該結(jié)果直接證明制備的單克隆抗體與魚腸道弧菌發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng),但是對照 Tang等[21]和林海英等[12]的試驗,發(fā)現(xiàn)熒光比例不是很高。推測原因可能有兩方面:一是采用雜交瘤細胞培養(yǎng)上清進行檢測,其效價遠低于小鼠腹水,結(jié)合細菌抗原較少[13];二是抗原制備和間接熒光標(biāo)記試驗過程中操作步驟較多,細胞破碎幾率增大,部分抗體未能與抗原表位發(fā)生特異性結(jié)合,導(dǎo)致FCM檢測結(jié)果中熒光比例不是很高[12,20]。

目前,魚腸道弧菌檢測主要通過對細菌生理生化指標(biāo)測定等傳統(tǒng)方法,其耗時長、工作量大[3-4],本研究中利用單克隆抗體對人工感染魚腸道弧菌的牙鲆進行了初步ELISA檢測,該結(jié)果對建立魚腸道弧菌快速診斷技術(shù)具有一定的實際應(yīng)用意義,但并未進行大范圍使用,開發(fā)可應(yīng)用于生產(chǎn)實踐中的ELISA商品檢測試劑盒等還有待于進一步研究。

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Preparation and characterization of monoclonal antibodies against Vibrio ichthyoenteri

WU Xiao-chun1,DENG Deng1,LIU Hui1,CHENG Shun-feng1,ZHANG Xiao-jun2

(1.College of Marine Science and Engineering,Qingdao Agricultural University,Qingdao 266109,China;2.Jiangsu Key Laboratory of Marine Biotechnology,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China)

Five monoclonal antibodies(MAbs)(1C6,1D8,2D7,2D10,2E3)against Vibrio ichthyoenteri as a pathogen in marine animals were produced from hybridoma cells through Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)and Indirect Immunofluorescence Assay Test(IFAT)by immunised Balb/C mice.The western blotting revealed that the protein of V.ichthyoenteri was shown to have molecular weight of 44 200 and 36 700,and the flowing cytometry(FCM)analysis showed that the MAb 2D10 reacted with positive cells had positive percent of 13.63%,and negative percent of less than 1%.Artificial infection experiment proved that the application of monoclonal antibody provided a method for the early diagnosis of V.ichthyoenteri.

Vibrio ichthyoenteri;monoclonal antibody;preparation

S948

A

2013-04-18

國家自然科學(xué)基金資助項目 (30901106);江蘇省水產(chǎn)三項工程項目 (PJ2010-58,DY2012-3-7);連云港市科技攻關(guān)項目(CG1134);青島農(nóng)業(yè)大學(xué)高層次人才科研基金資助項目 (630701)

吳曉春 (1988-),女,碩士研究生。E-mail:wuxiaochun1223@163.com

程順峰 (1978-),男,副教授。E-mail:chengshunfeng@163.com

2095-1388(2013)03-0259-05