蛇床子素體外對人前列腺癌DU145 細胞增殖的抑制作用及機制

張 毅，佟笑竹，徐小嫚，張 萌，曲 丹，何 平*

前列腺癌是嚴重威脅老年男性健康的疾病，是老年男性最常見的惡性腫瘤之一［1-2］。目前藥物治療方法主要有化療、內(nèi)分泌治療以及中藥治療等［3］。但臨床治療效果不能令人滿意，因此，尋找對前列腺癌更有效的治療藥物尤為重要。蛇床子素是蛇床子果實中提取的一種天然化合物。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有抗心律失常、增強免疫功能、抗菌及抗病毒等多種藥理作用［4-5］，且在抗腫瘤方面的作用明顯，可抑制多種腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞侵襲等［6-10］。但蛇床子素對前列腺癌的抑制作用未見報道。本實驗就蛇床子素對人前列腺癌DU145 細胞增殖的影響及機制進行研究，以期為臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人前列腺癌DU145 細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫;蛇床子素(純度≥98%)購自中國藥品生物制品檢定所，溶解于二甲基亞砜(DMSO)，配制成100 mmol/L 的儲存液，-20 ℃保存?zhèn)溆?RPMI-1640 培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶購自美國Hyclone 公司;胎牛血清購自天津索萊寶生物工程有限公司;四甲基偶氮唑藍(MTT)、DMSO 及Hoechst 33342 購自美國Sigma公司;AnnexinV/PI 雙染試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司;甲醇、冰乙酸由中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 細胞培養(yǎng) 人前列腺癌DU145 細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)基在37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)傳代。

1.3 MTT 法檢測細胞增殖 將DU145 細胞制成1 ×105/mL 的細胞懸液，每孔100 μL 接種于96 孔板內(nèi)，實驗每個劑量設3 個平行孔。于37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，加系列稀釋含蛇床子素的培養(yǎng)基，使其終濃度依次為30、60、90、120 μmol/L。實驗同時設含RPMI-1640 全培養(yǎng)基的空照和未予藥物作用的陰性對照，24、48 h各測1 次指標。方法為在各檢測時間前4 h，每孔加入MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)至實驗結束。棄上清，每孔加DMSO 150 μL，振蕩混勻，酶標儀檢測波長570 nm 的每孔光密度值(OD 值)。計算細胞的增殖抑制率，抑制率=1-加藥組OD 值/對照組OD 值×100%，實驗重復3 次。

1.4 流式細胞儀AnnexinV/PI 雙染法檢測蛇床子素誘導DU145 細胞凋亡 將DU145 細胞制成5 ×105/mL 的細胞懸液，每孔2 mL 接種于6 孔板中，于37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入蛇床子素，使各組蛇床子素的終濃度為0、30、90 μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。胰酶消化、離心收集細胞。用500 μL 1 ×Binding Buffer懸浮細胞，調(diào)整細胞濃度為1 ×106/mL。在細胞懸浮液中加入5 μL AnnexinV-FITC 輕輕混勻，再加入5 μL PI 后輕輕混勻，避光孵育15 min，1 h 內(nèi)用流式細胞儀檢測。實驗重復3 次。

1.5 熒光電子顯微鏡觀察DU145 細胞凋亡形態(tài) 將DU145 細胞制成5 ×105/mL 的細胞懸液，每孔2 mL 接種于6 孔板中，于37 ℃，飽和濕度、5%二氧化碳的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入蛇床子素，使蛇床子素的終濃度為0、90 μmol/L 繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄上清，冷PBS 洗2 次，冷風吹干，固定液(甲醇與冰乙酸的體積比為3∶1)固定15 min，PBS再洗 1 次。加入 Hoechst 33342 熒光染料(5 mg/L)1 mL，37 ℃避光孵育15 min，于熒光顯微鏡下觀察、照相。實驗重復3 次。

1.6 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，組間比較用單因素方差分析(ANOVA)，兩組之間比較采用t 檢驗，P ＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 青藤堿對DU145 細胞體外增殖的抑制作用 MTT 法檢測結果顯示，不同濃度的蛇床子素作用于DU145 細胞24 、48 h 后，細胞增殖水平明顯受到抑制。隨著濃度的增大和作用時間的延長，蛇床子素對DU145 細胞的增殖有明顯的抑制作用，這種抑制效應呈現(xiàn)明顯的時間劑量依賴性(P＜0.05)(見圖1)。

圖1 蛇床子素對人前列腺癌DU145 細胞增殖的抑制作用

2.2 流式細胞檢測蛇床子素誘導DU145 細胞凋亡 流式細胞儀AnnexinV/PI 雙染法檢測結果顯示，不同濃度蛇床子素作用于DU145 細胞24 h 后，隨著蛇床子素濃度的增加，早期凋亡和晚期凋亡細胞的比例都逐漸增加，并呈劑量依賴性(見圖2)。

圖2 流式細胞儀檢測蛇床子素誘導DU145 細胞凋亡

2.3 熒光電子顯微鏡觀察細胞凋亡形態(tài) Hoechst 33342 染色熒光顯微鏡觀察結果顯示，90 μmol/L蛇床子素作用于DU145 細胞24 h 后，細胞核形態(tài)變化顯著，呈現(xiàn)核固縮、核碎裂等典型凋亡改變。而空白對照組無相應改變，細胞核形態(tài)正常(見圖3)。

3 討論

本研究選取的藥物蛇床子素又名甲氧基歐芹酚或歐芹酚甲醚，是從傘形科植物成熟果實蛇床子中提取分離出的天然香豆素類化合物，其化學名稱為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素。近年來，有關蛇床子素藥理作用的研究有了很大進展，國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，其具有抗心律失常、增強免疫功能、抗菌及抗病毒等多種藥理活性［4-7］。

圖3 熒光電子顯微鏡(Hoechst33342 染色400 ×)觀察細胞核形態(tài)變化

近年來的研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素具有明顯抗腫瘤活性。Xu 等［6-7］研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素可以通過將細胞周期阻滯于G2/M 期及誘導細胞凋亡抑制肺腺癌A549 細胞增殖，其分子機制與調(diào)控PI3K/Akt 通路有關;蛇床子素可以抑制A549 細胞侵襲及轉(zhuǎn)移，其機制與抑制MMP-2、MMP-9 表達有關。Yang 等［8］報道，蛇床子素可以通過抑制MMP-2表達，抑制乳腺癌細胞系MCF-7 和MDA-MB 231的侵襲。Hung 等［9］進一步研究發(fā)現(xiàn)，蛇床子素通過抑制c-Met/Akt/mTOR 通路，發(fā)揮其抑制乳腺癌MCF-7 細胞侵襲及轉(zhuǎn)移的作用。Zhang 等［10］報道，蛇床子素抑制肝癌細胞增殖、誘導細胞阻滯于G2/M 期、誘導細胞凋亡，其機制與抑制NF-kB活性相關。此外，蛇床子素還可誘導宮頸癌Hela細胞凋亡［11］，誘導白血病HL-60 細胞凋亡［12］，對肺癌細胞接種的荷瘤小鼠有抑制腫瘤生長作用［13］。但蛇床子素對前列腺癌是否有抑制作用未見報道。本實驗采用人前列腺癌DU145 細胞為研究對象，實驗結果表明，蛇床子素對DU145 細胞的增殖具有抑制作用，并且有時間劑量依賴關系。蛇床子素可誘導DU145 細胞凋亡，熒光顯微鏡觀察到了細胞凋亡的形態(tài)，進一步證實了蛇床子素的抗前列腺癌作用。

綜上所述，蛇床子素可以抑制前列腺癌DU145 細胞的增殖，其機制可能與誘導細胞凋亡有關。本研究為蛇床子素在治療前列腺癌方面提供了實驗依據(jù)，其詳細分子機制有待進一步深入研究。

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