發(fā)酵乳制品中益生菌生存能力影響因素的研究進(jìn)展

文 / 周曉丹 張 昊 郭慧媛 任發(fā)政

（中國農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部-北京市共建功能乳品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

1 前言

在世界范圍內(nèi)，消費(fèi)者對(duì)食品影響健康的意識(shí)逐漸增強(qiáng)，這也使得功能食品的消費(fèi)成為一種趨勢。2000年、2005年和2010年，功能性食品在全球的市場份額分別為330 億、735 億和1 670 億美元[1]。益生菌食品被視為功能食品市場的一個(gè)重要組成部分，占市場總量的60%～70%。益生菌是可能存在于宿主（人類/動(dòng)物）腸道中的活的微生物（不包括霉菌），具有確定的一種或多種益生功能。乳酸桿菌和雙歧桿菌是目前發(fā)酵乳制品中最常使用的菌種。發(fā)酵乳制品中很多常見的益生功能都來自于益生菌，其中普遍承認(rèn)的作用有抗癌、抗誘變、刺激免疫系統(tǒng)（免疫調(diào)節(jié)）、抗感染，降低血清膽固醇，緩解乳糖不耐癥以及增強(qiáng)營養(yǎng)[2]。

根據(jù)食品法典委員會(huì)的定義，發(fā)酵乳制品是一種“通過發(fā)酵鮮奶得到的乳制品，產(chǎn)品可能會(huì)經(jīng)過合適的微生物的作用而使組分改性，從而降低了pH值，產(chǎn)生凝乳現(xiàn)象（等電點(diǎn)沉淀）”[3]。發(fā)酵乳制品在全世界廣泛制造，大約有400 個(gè)通用名稱被應(yīng)用到傳統(tǒng)和商業(yè)產(chǎn)品中。但這其中實(shí)際的產(chǎn)品種類可能只有少數(shù)幾種，酸奶是世界上最受歡迎的發(fā)酵乳制品[4]，其它的發(fā)酵乳制品還有發(fā)酵奶酪，基于發(fā)酵乳的飲料（如酸乳酒，馬奶酒，Ayran酸奶汁，Doogh酸奶飲料），經(jīng)發(fā)酵的冰淇淋，發(fā)酵乳制品甜點(diǎn)以及酸奶油等。

對(duì)于一個(gè)益生菌產(chǎn)品，發(fā)揮其益生功能，直到保質(zhì)期最后益生菌仍保持較強(qiáng)的活力，是其品質(zhì)最關(guān)鍵的評(píng)價(jià)準(zhǔn)則[5，6]。雖然全球沒有公認(rèn)的產(chǎn)品中益生菌的最小含量標(biāo)準(zhǔn)，但通常濃度為106CFU/mL和107～108CFU/mL（或CFU/g）分別是被普遍接受的最小和令人滿意的劑量水平[3，5，7]。在發(fā)酵乳制品生產(chǎn)和貯存過程中，益生菌的生存能力受配方、生產(chǎn)工藝和環(huán)境條件等諸多因素的影響[8～10]。本文對(duì)這些影響益生菌生存能力的主要因素進(jìn)行了概述。

2 益生菌菌株和發(fā)酵菌株間的生物關(guān)系

由于益生菌無法在充分發(fā)酵的同時(shí)又保證發(fā)酵乳制品令人滿意的感官品質(zhì)，所以通常會(huì)在其中添加傳統(tǒng)的發(fā)酵菌種，這被稱為“支持培養(yǎng)”或“輔助培養(yǎng)”。益生菌在牛奶中生長緩慢會(huì)提高有害微生物生長的風(fēng)險(xiǎn)，而且若菌株生長不良，也可能會(huì)產(chǎn)生不愉快的味道[5]。只添加益生菌的發(fā)酵乳制品，其培養(yǎng)時(shí)間可能會(huì)延長到8～24 h，而使用傳統(tǒng)發(fā)酵菌株只需要3～4 h[11]。因此，發(fā)酵功能食品最需要關(guān)注的就是發(fā)酵劑和益生菌之間的相互作用。

針對(duì)不同的益生菌，發(fā)酵菌株與益生菌菌株之間會(huì)呈現(xiàn)協(xié)同或拮抗兩種作用，這取決于二者的種類以及組成成分和工藝條件[12]。通過產(chǎn)生一些促進(jìn)益生菌生長的物質(zhì)或消耗某些抑制因素，發(fā)酵菌株可以為益生菌提供一個(gè)良好的生長環(huán)境。然而，益生菌的生存可能會(huì)受到包括乳酸、過氧化氫、細(xì)菌素，甚至是揮發(fā)性化合物在內(nèi)的發(fā)酵菌株代謝產(chǎn)物的影響[13]，保加利亞乳桿菌在發(fā)酵過程中會(huì)急劇產(chǎn)酸，然后在冷藏過程中繼續(xù)緩慢產(chǎn)酸（后酸化過程）。上述現(xiàn)象均會(huì)導(dǎo)致酸奶產(chǎn)生不愉快酸味，同時(shí)降低益生菌的生存能力[5]。因此，在決定發(fā)酵乳制品培養(yǎng)成分時(shí)，最主要的原則是選擇兼容且合適的益生菌混合物和發(fā)酵劑。

選擇用于食品生產(chǎn)的益生菌菌株應(yīng)考慮其對(duì)產(chǎn)品的兼容性和拮抗性兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)[4]。乳酸桿菌和雙歧桿菌是目前用于發(fā)酵益生菌酸奶最重要的菌種。兩歧雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、短雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌、約氏乳桿菌、洛德乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、副干酪乳桿菌、代田乳桿菌、乳酸腸球菌、小球菌等目前都可用于生產(chǎn)益生菌發(fā)酵乳制品，其產(chǎn)品包括酸奶、酪乳、酸乳酒和馬奶酒等[14，15]。益生菌在產(chǎn)品中（對(duì)pH值、總酸含量、氧氣毒性、凍結(jié)、低溫或相對(duì)較高的儲(chǔ)存溫度等惡劣條件的抵抗）和生活消費(fèi)條件下的耐受性依賴于菌株本身的特異性[16～19]。雙歧桿菌是嚴(yán)格厭氧菌，高氧含量會(huì)影響其正常生長和活性，然而由于其對(duì)于酸、低pH值和分子氧等有害環(huán)境因素的良好耐受能力，乳雙歧桿菌雖然并不來自于人類，卻是發(fā)酵乳制品中最常用的雙歧桿菌菌株[20]。

3 發(fā)酵乳制品中對(duì)益生菌有害的因素

3.1 低pH值和總酸含量

低pH值和總酸含量是影響發(fā)酵乳制品中益生菌生長和穩(wěn)定性的重要因素。嗜酸乳桿菌最適生長的pH值為5.5～6.0，而雙歧桿菌為6.0～7.0[9]。當(dāng)pH值低于5.5時(shí)，嗜酸乳桿菌細(xì)胞的生長會(huì)明顯減慢[7]。然而，雙歧桿菌屬的某些菌種對(duì)酸的耐受能力是有菌株特異性的。氫離子會(huì)中斷通過細(xì)胞膜的質(zhì)量傳遞，并導(dǎo)致細(xì)胞酸性饑餓，從而對(duì)益生菌細(xì)胞造成損害[5]。發(fā)酵乳制品中過低的pH值可能會(huì)引起非游離態(tài)有機(jī)酸濃度的升高，從而增強(qiáng)了這些酸的殺菌作用。

發(fā)酵乳制品中的酸含量與氧化還原電位值呈正相關(guān)，而氧化還原電位值越高對(duì)雙歧桿菌的活性越不利[12]。通常在發(fā)酵乳制品中，相比于總酸含量，益生菌對(duì)pH值相關(guān)的壓力更為敏感（pH值和pH值下降速率）?？偹岷恐饕窃趦?chǔ)存過程中對(duì)益生菌活性的影響較大[21，22]。

3.2 溶解氧和過氧化氫

乳酸桿菌可以好氧或厭氧并嚴(yán)格發(fā)酵，而雙歧桿菌則嚴(yán)格厭氧并可分解糖類[9]，因此，分子氧不利于益生菌的生長和存活。然而，對(duì)氧的敏感性在不同菌種和菌株之間差別很大。一般情況下，乳酸桿菌本質(zhì)上是微量需氧微生物，對(duì)氧的耐受性強(qiáng)于雙歧桿菌。

氧在三個(gè)方面影響益生菌的培養(yǎng)。首先，它對(duì)一些細(xì)胞有直接毒性；第二，某些益生菌培養(yǎng)在有氧條件下，特別是像保加利亞乳桿菌，會(huì)產(chǎn)生對(duì)益生菌細(xì)胞有毒性的過氧化物，這也是嗜酸乳桿菌在ABY型酸奶（特指其發(fā)酵所用菌種為嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌、嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌的酸奶）發(fā)酵和儲(chǔ)存過程中活性損失的主要原因[23，24]；第三，各種成分氧化作用產(chǎn)生的自由基（如脂肪）對(duì)益生菌細(xì)胞也是有毒性的[5，22]。有許多方法可以降低發(fā)酵乳制品中的氧含量，最主要的便是在真空下完成發(fā)酵。使用真空包裝和對(duì)氧氣滲透性低的包裝材料，在牛奶中添加抗氧化劑和除氧劑（如抗壞血酸），并控制生產(chǎn)過程，這樣可以使溶解氧的含量達(dá)到最小值[25]。

3.3 添加劑

目前乳品行業(yè)中使用的食品添加劑會(huì)顯著影響發(fā)酵劑（如嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、乳酸乳球菌）和益生菌（如嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌、副干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和雙歧桿菌）的生長和活性[26]。這些添加劑包括鹽（NaCl和KCl）、糖（蔗糖和乳糖）、甜味劑（安賽蜜和阿斯巴甜）、芳香化合物（二乙酰、乙醛和乙偶姻）、天然色素、調(diào)味劑、調(diào)味著色劑、乳酸鏈球菌素、那他霉素和溶菌酶等[4，26]。

研究證明，益生菌對(duì)乳品添加劑的耐受性比發(fā)酵菌更強(qiáng)[27]。當(dāng)NaCl達(dá)到一定的濃度（如0.5%～1.0%）時(shí)即會(huì)對(duì)益生菌生長和活性產(chǎn)生刺激作用[28]。添加精油也不利于益生菌的生存，在儲(chǔ)存期間，濃度為0.2%的薄荷和新塔花香精即可導(dǎo)致嗜酸乳桿菌LA-5和乳雙歧桿菌BB-12活菌數(shù)量的顯著減少[4]。

4 發(fā)酵乳制品中促進(jìn)益生菌生長的因素

4.1 生長因子和生長促進(jìn)劑

由于缺少非蛋白氮和一些維生素，以及β-半乳糖苷酶和蛋白水解酶缺乏活性，乳酸桿菌，特別是雙歧桿菌在牛奶中容易生長不良[18，25]。為解決生長緩慢的問題，通用的一個(gè)很好的方法就是使用各種生長因子和生長促進(jìn)劑來強(qiáng)化牛奶，如酪蛋白、乳清蛋白水解物、L-半胱氨酸、酵母提取物、葡萄糖、維生素、礦物質(zhì)和抗氧化劑等。這些補(bǔ)充物對(duì)益生菌的存活有顯著的促進(jìn)作用[25]。由于蛋白質(zhì)衍生物對(duì)細(xì)胞的營養(yǎng)價(jià)值，以及降低培養(yǎng)基的氧化還原電位和增加培養(yǎng)基的緩沖能力等特性，其促進(jìn)益生菌生長的作用最為顯著。“益生元”是不易消化的食品配料，會(huì)被腸道內(nèi)的有益菌選擇性代謝以促進(jìn)其生長。它們大多是二碳到十碳的低聚糖類化合物，在很大程度上能抵抗胰腺和刷狀緣酶的消化，有助于保持益生菌在產(chǎn)品及腸道內(nèi)的生存能力[21]。

4.2 產(chǎn)品中的益生菌保護(hù)因素

產(chǎn)品的緩沖能力，以及其固體基質(zhì)特性可以顯著影響益生菌細(xì)胞的生存能力。由于其將pH值維持在了較高水平，因此增加牛奶的緩沖能力可增強(qiáng)益生菌的活性。此外，高緩沖能力產(chǎn)品的pH值在發(fā)酵和冷藏過程中下降緩慢，使益生菌細(xì)胞的存活率更高[13，28]。奶酪和酸奶緩沖能力很強(qiáng)，益生菌在其中的生存能力也遠(yuǎn)高于發(fā)酵乳飲料。另外還可以通過添加小麥、大麥和麥芽提取物到牛奶中來增加產(chǎn)品的緩沖能力[29]。

與液體食品不同，產(chǎn)品中的固體基質(zhì)，如酸奶或奶酪的凝膠結(jié)構(gòu)，則通過減少其暴露于有害因素中的機(jī)會(huì)來保護(hù)益生菌細(xì)胞[4，22]。這些基質(zhì)可作為物理或化學(xué)屏障阻斷H+和有機(jī)酸這類水相環(huán)境的不利因素[28]。另有報(bào)道指出，通過在食品原料中形成致密基質(zhì)，乳酸菌胞外多糖也可提高益生菌在胃腸道中的生存能力[30]。

5 發(fā)酵乳制品加工工藝對(duì)益生菌的影響

5.1 發(fā)酵溫度和時(shí)間

發(fā)酵溫度和時(shí)間是影響益生菌生存能力最重要的因素。雖然嗜酸乳桿菌可在高達(dá)45 ℃條件下生長，但其最適溫度為40～42 ℃，雙歧桿菌最適生長溫度為37～41 ℃，發(fā)酵菌種則為42～45 ℃[31]。混合益生菌培養(yǎng)，特別是發(fā)酵菌種與益生菌共同培養(yǎng)時(shí)，選擇適當(dāng)溫度更加重要。研究表明，在ABY型培養(yǎng)組分中，發(fā)酵溫度過高，益生菌生存能力越低，這是因?yàn)楦邷叵掳l(fā)酵菌種比益生菌生存能力更強(qiáng)[24，31]。

5.2 接種條件

在進(jìn)行不同種類的發(fā)酵時(shí)，接種條件也不同，包括發(fā)酵后接種、連續(xù)發(fā)酵和單獨(dú)發(fā)酵。益生菌發(fā)酵乳制品中添加發(fā)酵劑可提高發(fā)酵速率，并產(chǎn)生酸奶特有的風(fēng)味和質(zhì)地。然而，益生菌和發(fā)酵菌種共同培養(yǎng)會(huì)降低益生菌的生存能力，這是因?yàn)榘l(fā)酵過程中發(fā)酵菌種生長更快，而且會(huì)產(chǎn)生一些物質(zhì)抑制益生菌生長。為克服此問題，可在發(fā)酵后加入益生菌，即“發(fā)酵后接”，使用這種方法，培養(yǎng)時(shí)間顯著縮短[4，32]。此外，也可以讓益生菌和發(fā)酵劑先分別單獨(dú)生長，然后再將兩者混合[5]。這樣可以使益生菌增殖到理想數(shù)量，又不會(huì)影響發(fā)酵劑的發(fā)酵過程。然而，一些證據(jù)表明，發(fā)酵后接種益生菌，會(huì)降低其耐受性，并使其暴露于環(huán)境壓力中，這又會(huì)反過來導(dǎo)致益生菌細(xì)胞生存能力大量損失[5，22，28]。

在連續(xù)發(fā)酵中，益生菌比發(fā)酵菌種增殖更快，或二者在適宜溫度下同時(shí)增殖。在“兩步式發(fā)酵”過程中，初始為益生菌培養(yǎng)，然后再由一種或兩種發(fā)酵劑完成發(fā)酵，使益生菌在最終達(dá)到停滯期或在初始階段達(dá)到對(duì)數(shù)期。此過程結(jié)束時(shí)會(huì)得到一個(gè)相當(dāng)高的益生菌數(shù)量，而發(fā)酵時(shí)間會(huì)稍長[33]。連續(xù)發(fā)酵過程可以改變發(fā)酵溫度，37 ℃開始讓益生菌生長，然后逐步升溫至40 ℃、42 ℃或44 ℃來改善風(fēng)味和質(zhì)地[22]。

接種量會(huì)影響益生菌生存能力、發(fā)酵時(shí)間以及最終產(chǎn)品的感官品質(zhì)。益生菌與發(fā)酵劑間的接種比率是一個(gè)關(guān)鍵因素。發(fā)酵劑和益生菌之間以較低比例接種會(huì)延長發(fā)酵時(shí)間，感官性狀也不理想。相反較高比例則會(huì)使發(fā)酵菌種大量生長，保加利亞乳桿菌的過度酸化現(xiàn)象也會(huì)降低益生菌生存能力[4，13，22]。然而，在缺乏營養(yǎng)的培養(yǎng)基上過度提高接種量可能會(huì)導(dǎo)致相反結(jié)果，由于營養(yǎng)競爭和拮抗作用，發(fā)酵劑生存能力會(huì)下降。除了接種量，培養(yǎng)液中的活細(xì)胞濃度也應(yīng)加以考慮，接種量恒定時(shí)，增加培養(yǎng)液的活細(xì)胞濃度，產(chǎn)品中細(xì)胞數(shù)量也會(huì)提高[13]。

5.3 儲(chǔ)存溫度和時(shí)間

由于溫度對(duì)細(xì)胞存活有影響，因此發(fā)酵乳制品的貯存溫度會(huì)影響益生菌的生存能力，以及發(fā)酵菌種代謝物的類型和濃度[34]。有報(bào)道指出ABY型酸奶在2 ℃條件下存儲(chǔ)20 天，其嗜酸乳桿菌LA-5活性達(dá)到最高，而乳雙歧桿菌BB-12在8 ℃條件下儲(chǔ)存會(huì)獲得最大活性。已經(jīng)證實(shí)雙歧桿菌細(xì)胞在低儲(chǔ)存溫度下（2 ℃以下）抵抗力較低[35]。所以益生菌發(fā)酵乳制品應(yīng)存儲(chǔ)在冷藏溫度下，優(yōu)選4～5 ℃。

存儲(chǔ)時(shí)間與益生菌的生存能力成一定的比例，因?yàn)闀r(shí)間延長增強(qiáng)了有害因素對(duì)益生菌的不利影響。盡管益生菌對(duì)于惡劣環(huán)境的抵抗力有菌株特異性，發(fā)酵乳制品pH值低于4.2時(shí)（如許多發(fā)酵乳飲料），要實(shí)現(xiàn)每個(gè)益生菌菌株活菌數(shù)量都保持在107CFU/mL以上，且保質(zhì)期超過21 天是很難的[34]。相比發(fā)酵乳飲料，具有高pH值（4.4～4.6）和高緩沖力的益生菌酸奶，則可以實(shí)現(xiàn)更長的保質(zhì)期。高于5 ℃存儲(chǔ)保質(zhì)期超過約3 周的ABY型酸奶，可能會(huì)導(dǎo)致保加利亞乳桿菌大量生長，這種后酸化作用會(huì)顯著降低益生菌的生存能力[34]。

6 小結(jié)與展望

發(fā)酵乳制品是健康食物，益生菌會(huì)產(chǎn)生額外的健康功效。益生菌發(fā)酵乳制品是現(xiàn)在最受歡迎的食品。對(duì)于這種產(chǎn)品，發(fā)酵是關(guān)鍵環(huán)節(jié)，它是由益生菌單獨(dú)或輔助發(fā)酵劑共同作用實(shí)現(xiàn)的。益生菌被添加到發(fā)酵乳制品中，其許多特性與最終產(chǎn)品的質(zhì)量和屬性有關(guān)。這些特性包括益生菌細(xì)胞的安全性，生產(chǎn)和儲(chǔ)存過程中益生菌的生存能力，益生菌與發(fā)酵劑的酸化速率，以及其生產(chǎn)出具有優(yōu)良感官品質(zhì)和合理價(jià)格的產(chǎn)品的能力?，F(xiàn)有的大量研究都是針對(duì)產(chǎn)品配方和生產(chǎn)工藝的優(yōu)化，而益生菌在發(fā)酵乳制品中的生存能力更是保證產(chǎn)品品質(zhì)和性能的關(guān)鍵所在。未來發(fā)展前景必將是基于分離新的益生菌菌株，改造修飾現(xiàn)有益生菌和發(fā)酵劑并不斷完善配方和工藝，以獲得其良好的生存活力以及更好的健康功效，關(guān)于諸如益生菌和益生元微膠囊化等新技術(shù)的研究也會(huì)受到特別關(guān)注。

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