rAAV2/1-Acrp30對實(shí)驗(yàn)性糖尿病對大鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

王 靜鐘惠菊周 軍李 瓊王適龍

（1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410078；2 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410013）

rAAV2/1-Acrp30對實(shí)驗(yàn)性糖尿病對大鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響

王 靜1鐘惠菊1周 軍2李 瓊1王適龍1

（1 中南大學(xué)湘雅醫(yī)院，湖南 長沙 410078；2 中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410013）

目的 觀察rAAV2/1-Acrp30對實(shí)驗(yàn)性糖尿病對大鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。方法 以高脂高糖喂養(yǎng)4周加上35mg/kgSTZ腹腔注射建立大鼠糖尿病模型，將其隨機(jī)分為糖尿病對照組組、脂聯(lián)素治療組、空病毒組，并設(shè)正常對照組。結(jié)果 模型組較正常對照組血糖、飲水量、體質(zhì)量均明顯升高（P＜0.01），血清APN顯著下降（P＜0.01）；與糖尿病對照組及空病毒組相比，治療組的飲水量、空腹血糖的情況是顯著降低（P＜0.05），體質(zhì)量上升（P＜0.05），血清TC、TG、LDL降低（P＜0.05），HDL明顯升高（P＜0.05）；肝臟形態(tài)學(xué)表明肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰且完整，肝細(xì)胞脂肪變性與炎癥細(xì)胞浸潤呈減少的特點(diǎn)；肝臟APN的表達(dá)呈上升特點(diǎn)（P＜0.01），肝臟NF-κBp65、IκBα與IL-1β明顯降低（P＜0.05）。結(jié)論 rAAV2/1-Acrp30能夠降低血糖與血脂，較好的改善糖尿病大鼠肝臟炎性細(xì)胞的浸潤以及肝細(xì)胞脂肪變性。

實(shí)驗(yàn)性；糖尿?。淮笫蟾闻K細(xì)胞；NF-κBp65

脂聯(lián)素（APN）具有增加胰島素敏感性、抗炎、抗動脈粥樣硬化以及抗糖尿病的功能，其循環(huán)濃度在胰島素抵抗或2型糖尿病等患者中[1]都降低，而給予小鼠的體內(nèi)注射重組脂聯(lián)素就會使得模型鼠血糖降低同時(shí)優(yōu)化胰島素抵抗[2]。本研究觀察rAAV2/1-Acrp30對實(shí)驗(yàn)性糖尿病對大鼠肝臟細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 動物模型制備

8周齡雄性Wistar大鼠50只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為兩組，正常對照組（C）8只以普通飼料喂養(yǎng)，模型組（M）42只喂以高糖高脂飼料。4周后M組大鼠隔夜空腹腹腔注射STZ35mg/kg，C組僅注射等體積檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。72h后大鼠測隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L為糖尿病模型造模成功。

1.2 給藥方式

將造模成功的27只大鼠隨機(jī)分為糖尿病對照組、空病毒組以及脂聯(lián)素治療組，每組n=9。各組大鼠從造模成功次日開始給藥rAAV2/1-Acrp30基因（滴度為1012 vector genomes/mL，vg/mL，由前期實(shí)驗(yàn)組構(gòu)建[3]）。觀察4周后處死。在這階段，正常對照組進(jìn)行普通飼料的喂養(yǎng)，其余3組則予以高糖高脂的飼料進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.3 生化指標(biāo)檢測

分別于4周、8周末斷尾取血測血糖（BG），8周末隔夜空腹從心臟取血測定FBG，血清TG、TC、HDL、LDL、APN，之后將其處死。FBG用強(qiáng)生快速血糖儀進(jìn)行測定；血清TG、TC等則用全自動的生化分析儀進(jìn)行測定，血清脂聯(lián)素采用酶聯(lián)免疫法。

1.4 肝臟組織病毒組織學(xué)觀察

取小塊的肝組織4%多聚甲醛固定，用石蠟包埋，切片，Masson染色及Red-oil特殊染色，對病理情況進(jìn)行觀察[4]。

1.5 免疫組化染色和圖像分析

免疫組化染色采用ABC法，DAB顯色，并以PBS作空白對照。陽性結(jié)果是胞漿/胞核染成棕黃色。組織切片都通過NIS-Elements AR 3.0軟件拍照來收集到全組織的切面圖像。用雙盲法來進(jìn)行分析，在高倍鏡下隨機(jī)的確定10個(gè)視野，計(jì)同類細(xì)胞中陽性細(xì)胞所具有的個(gè)數(shù)，取樣本的平均值進(jìn)行組間的比較。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較，采用t檢驗(yàn)和SNK-q檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 rAAV2/1-acrp30對糖尿病大鼠一般情況影響

C組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中精神狀態(tài)良好，活動靈活，毛色光潔，后期體質(zhì)量增加。D組和V組大鼠精神狀態(tài)萎靡，毛色晦暗、枯黃，進(jìn)食量、尿量、飲水量增加，體質(zhì)量減輕。A組大鼠精神狀態(tài)可，活動靈活，毛色稍晦暗，進(jìn)食量、尿量、飲水量較D組和V組有減少，后期體質(zhì)量略有增加。

2.2 rAAV2/1-acrp30對糖尿病大鼠血糖、血脂和血清脂聯(lián)素的影響

血清指標(biāo)顯示：rAAV2/1-Acrp30干預(yù)4周后，與D組和V組相比，A組血清FBG、TC、TG、LDL明顯降低（P＜0.05），HDL明顯升高（P＜0.05），血清APN無明顯差異（P＞0.05）。

2.3 肝臟肉眼觀察

模型組和空病毒組大鼠肝臟體積變大，外觀是灰黃色，邊緣呈圓鈍，質(zhì)地軟，表現(xiàn)為典型肝脂肪變狀態(tài)。脂聯(lián)素組大鼠肝臟體積出現(xiàn)了增大，外觀為紅色偏黃，質(zhì)地軟，和糖尿病對照組與空病毒組比有顯著的改善。

2.4 肝組織病理形態(tài)學(xué)變化

Masson染色顯示：C組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，分界清，核圓同時(shí)清晰，位于細(xì)胞中央，肝竇排列也規(guī)則。D組和V組大鼠肝細(xì)胞呈大小不等的空泡變性，部分胞核出現(xiàn)被擠壓于細(xì)胞邊緣的情況，肝索排列紊亂，大量的炎性細(xì)胞浸潤。A組大鼠肝細(xì)胞索結(jié)構(gòu)比較清楚，肝竇較為正常，出現(xiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤。在四組中，都沒有發(fā)現(xiàn)藍(lán)色纖維組織。箭頭所指處表示炎性細(xì)胞浸潤。

Red-oil染色顯示：C組肝組織可見極少量脂肪滴。D組和V組可見大量大小不等的脂肪滴存在。A組肝細(xì)胞脂肪變性明顯減輕，多以小脂滴狀存在。

2.5 rAAV2/1-acrp30對糖尿病大鼠肝臟APN及NF-κBp65、IκBα、IL-1β免疫組化染色的影響結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠APN、NF-κBp65、IκBα、IL-1β比較（）

表1 各組大鼠APN、NF-κBp65、IκBα、IL-1β比較（）

注：與C組比較AP＜0.01，aP＜0.05；與D組比較BP＜0.01，bP＜0.05；與V組比較CP＜0.01，cP＜0.05

組別鼠數(shù)APNNF-κBp65IκBαIL-1β C614.33±4.3212.5±3.390.33±0.520.50±0.55 D76.00±2.24A61.14±8.86A5.43±1.62A7.71±1.98AV75.43±2.82A55.29±6.10A5.14±1.95 A7.86±2.16AA717.86±4.02BC28.86±5.37ABC2.71±1.89abc5.14±1.35Abc

肝臟APN的表達(dá)提示：A組較D組和V組顯著升高（P＜0.01），D組和V組較C組顯著降低（P＜0.01）；肝臟NF-κBp65、IκBα、IL-1β的表達(dá)提示：A組較D組和V組明顯降低（P＜0.05），D組和V組較C組明顯增加（P＜0.01）。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，在糖尿病時(shí)，模型組肝臟中NF-κBp65、IκBα等的表達(dá)都較對照組是增加的，而在rAAV2/1-Acrp30治療一定階段后，細(xì)胞因子在治療組較對照組與空病毒組是降低的，且差異性比較明星，可以推測：NF-κBp65、IκBα、IL-1β在糖尿病時(shí)在肝臟的表達(dá)明顯升高，提示其參與了糖尿病的產(chǎn)生與發(fā)展，因而可通過抑制NF-κB、IκBα、IL-1β的活化，減少其產(chǎn)生，從而降低肝內(nèi)炎癥的反應(yīng)。

綜上所述，用腺相關(guān)病毒重組脂聯(lián)素治療可以降低血糖，優(yōu)化脂質(zhì)代謝紊亂，優(yōu)化糖尿病大鼠肝臟炎性細(xì)胞的浸潤與肝細(xì)胞的脂肪變性，減少IL-1β等炎癥因子在肝臟的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，更好的保護(hù)患者的肝臟，緩解糖尿病。

[1] Hotta K,Funahashi T,Arita Y,et al.Plasma concentrations of a novel,adipose specific protein,adiponectin,in type 2 diabetic patients[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2000,20(6):1595-1599.

[2] Maeda N,Shimomura L,Kishida K,et al.Diet-induced insulin resistance in mice lacking adiponectin/ACRP30[J].Nature Med, 2002,8(7): 731-737.

[3] 李強(qiáng)翔,鐘惠菊,盛杰,等.重組腺相關(guān)病毒介導(dǎo)的大鼠脂聯(lián)素載體的構(gòu)建與鑒定[J].現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2008,8(3):430-433.

[4] 于淼,樸春紅.從毒損肝絡(luò)探討胰島素抵抗、2型糖尿病炎癥發(fā)病機(jī)制[J].中華實(shí)用中西醫(yī)雜志,2006,19(6):614-615.

R587.1；R-33

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1671-8194（2013）36-0038-02