肝素衍生物的抗凝血活性評價

王 鶯*

（南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，廣東 廣州 510515）

肝素衍生物的抗凝血活性評價

王 鶯*

（南方醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所，廣東 廣州 510515）

目的評估一系列化學(xué)修飾肝素衍生物的抗凝血活性。方法應(yīng)用凝血儀測定肝素的部分活化凝血活酶時間（APTT）-肝素濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定肝素抗Ⅹa因子活性，制定其在405nm的吸光度-肝素濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后分別測定肝素衍生物的APTT和抗Ⅹa因子活性，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線評價肝素衍生物的抗凝活性。結(jié)果化學(xué)修飾能夠適當(dāng)降低肝素衍生物的抗凝血活性，并且隨著引入的有機(jī)基團(tuán)的增多，肝素衍生物的抗凝血活性逐漸下降，但仍然保持一定的生物活性，且應(yīng)用APTT評估肝素衍生物抗凝活性與應(yīng)用抗Ⅹa因子活性評估肝素衍生物抗凝活性，測定結(jié)果基本一致。結(jié)論相比較肝素，這些化學(xué)修飾的肝素衍生物有較低的抗凝血活性，為安全應(yīng)用這些肝素衍生物提供了更加廣闊的前景。

抗凝血活性；肝素衍生物；活化部分凝血活酶時間；抗Ⅹa因子活性

研究表明生物高分子具有良好的生物相容性和降解性，廣泛于應(yīng)用醫(yī)藥領(lǐng)域。由于生物高分子在腫瘤組織中有滲透、滯留效應(yīng)(EPR)[1]，生物高分子可與抗癌藥物結(jié)合，制備成新的藥物輸送系統(tǒng)，使藥物的溶解性得到改善、能夠適當(dāng)控制原藥的釋放速度、延長其體內(nèi)循環(huán)時間，同時可增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性等，這種生物大高子為與藥物結(jié)合的輸送系統(tǒng)，已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)之一，有廣闊的應(yīng)用前景[2,3]。

肝素（heparin）是一種天然糖胺聚糖，在動物組織和器官中廣泛存在，并有好的水溶性、生物相容性和降解性，具有抗凝、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌等多種生物學(xué)功能[4]。目前許多研究者開展了以肝素衍生物作為載體抗癌藥物輸送系統(tǒng)的工作，取得了很好的工作進(jìn)展。然而肝素最重要的生物學(xué)特征是抗凝作用，作為應(yīng)用最廣的抗凝血劑，它能夠破壞，抑制凝血酶的形成并阻止血小板聚集，但是用量過大，患者可能出現(xiàn)出血跡象，如血尿、咯血、消化道出血或顱內(nèi)出血等現(xiàn)象。因此以肝素衍生物為藥物載體，應(yīng)同時對其抗凝活性進(jìn)行檢測，保證載體的安全應(yīng)用。研究表明化學(xué)修飾能夠適當(dāng)降低肝素的抗凝血活性，且肝素衍生物還能保持其他的生物活性[5]，因此開展肝素衍生物的抗凝血活性評價，仍然十分必要。

目前實(shí)驗(yàn)室和臨床上常用活化部分凝血活酶時間（APTT）和抗凝血因子Ⅹa活性的測定作為抗凝性能評價的重要指標(biāo)，因此本文以一系列化學(xué)修飾的肝素衍生物為對象，通過測定它們的活化部分凝血酶時間（APTT）和抗Ⅹa因子活性，評估這些肝素衍生物的抗凝血活性，為進(jìn)一步深入研究工作提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

肝素鈉（Mw=15000Da，效價150 U/mg，伯奧生物科技公司，上海）；O-乙?；嗡兀琌-丁?；嗡睾蚈-丁二?；嗡兀ㄗ灾疲?；一次性真空采血管（BD Vacutainer）；APTT試劑盒（APTT試劑：腦磷脂、鞣花酸、防腐劑、穩(wěn)定劑；0.025mol/L CaCl2；太陽生物技術(shù)公司，上海）；抗Ⅹa試劑盒（Coatest，瑞典）；正常人混合血漿由湘雅附三醫(yī)院提供。PRECIL C2000型凝血儀（普利生儀器公司，北京）；DNM-9602酶標(biāo)儀（普朗醫(yī)藥儀器公司，北京）。

1.2 方法

1.2.1 活化部分凝血酶時間（APTT）的測定

一次性凝血常規(guī)采血管：采血管中抗凝劑是枸椽酸鈉（0.109M，0.3mL），真空控制抽血，血液與抗凝劑的比例為9∶1。正常人混合血漿的制備：一次性真空采血管取正常人靜脈血，搖勻后離心10min（3000rpm），收集上層黃色血漿。APTT的測定：用蒸餾水配肝素標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.15、0.3、0.45、0.6、0.75U/mL。用蒸餾水配待測樣為3μg/mL。將25μL肝素標(biāo)品溶液或待測樣溶液加入到0.1mL血漿中，搖勻后，加入100μL的APTT試劑。混合液在37℃下孵育2 min后，加入100μL預(yù)熱的CaCl2溶液。凝血儀自動記錄凝固時間。

1.2.2 抗Ⅹa因子的測定

取7.1nkat/mL的Ⅹa因子0.1mL，37℃保溫3 min后，加入0.2mL的0.1unit/mL抗凝血酶ATⅢ，用PBS(0.05mM，pH 8.4)配25μL的不同濃度肝素和肝素衍生物，然后加入0.1mL的1mmol/L底物S-2222，37℃孵育2 min，加入300μL的20%乙酸，終止反應(yīng)。測定肝素和肝素衍生物的吸光度（405nm）。制定肝素吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)肝素衍生物的吸光度，計算出相對活性。

1.2.3 統(tǒng)計分析

采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件（美國SPPS公司）進(jìn)行單向方差分析或t檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(χ—±s)表示。

2 結(jié) 果

血液凝固是一系列凝血因子的酶促反應(yīng)。在凝血過程中，通過內(nèi)源性凝血途徑或外源性凝血途徑可使血液凝血活酶形成。APTT是內(nèi)源凝血因子缺乏最可靠的篩選試驗(yàn)，測定方法靈敏而且簡便，因此可以被用來替代普通試管法凝血時間測定或者血漿復(fù)鈣時間的測定，正常的APTT一般在28～44s之間。由于APTT對血漿中的肝素、類肝素濃度較為靈敏，是使用較為廣泛的實(shí)驗(yàn)室監(jiān)護(hù)指標(biāo)。在本研究中我們應(yīng)用活化部分凝血活酶時間（APTT）對化學(xué)修飾的肝素衍生物抗凝性質(zhì)進(jìn)行測定。

凝血因子是指對血漿及組織中直接參與的凝血物質(zhì)。其中的一種在凝血過程中起著重要作用的糖蛋白-凝血因子Ⅹa（FⅩa）可以在凝血因子V、Ca2+、磷脂的輔助下，把凝血酶原活化為凝血酶。由于Ⅹa處于外源性和內(nèi)源性激活途徑的共同通路中心位置，因此Ⅹa生成后的凝血過程是兩條凝血路徑共有的，故Ⅹa因子抑制劑一方面能阻斷內(nèi)源性凝血，另一方面也能抑制外源性凝血的發(fā)生。因此，檢測抗Ⅹa因子的活性是另外一個評價抗凝性能的指標(biāo)。

通過測定肝素的APTT，回歸肝素濃度-APTT的標(biāo)準(zhǔn)方程：y=32.06+18.13333x，相關(guān)系數(shù)r=0.976，通過標(biāo)準(zhǔn)方程計算出相應(yīng)的肝素衍生物的相對抗凝活性。應(yīng)用酶標(biāo)儀測定肝素抗Ⅹa因子活性在405nm的吸光度-濃度標(biāo)準(zhǔn)方程：y=0.2907-0.338x，相關(guān)系數(shù)r=-0.9866，將肝素衍生物在405nm吸光值對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)方程，計算出相對抗凝活性，測定結(jié)果見表1。

表1 肝素衍生物抗凝血活性(χ—±s)

表1結(jié)果分析，以肝素作為標(biāo)準(zhǔn)對照，應(yīng)用APTT和抗Ⅹa因子法檢測結(jié)果表明，合成的肝素衍生物的抗凝活性較肝素有所下降，說明酰化反應(yīng)對肝素修飾后，部分降低了其抗凝活性，隨著引入有機(jī)基團(tuán)的分子量的增大，肝素衍生物的抗凝活性均呈下降的趨勢，但都保持了一定的抗凝活性，應(yīng)用抗Ⅹa因子活性與應(yīng)用APTT測定結(jié)果一致。

3 結(jié) 論

我們應(yīng)用兩種抗凝血活性測試方法對肝素衍生物的抗凝效果進(jìn)行評價，研究表明兩種測試方法對抗凝效果評價基本一致，即化學(xué)修飾能夠適當(dāng)降低肝素衍生物的抗凝血活性，隨著引入的有機(jī)基團(tuán)的增多，肝素衍生物的抗凝血活性逐漸下降，但仍然保持一定的生物活性，對安全應(yīng)用肝素衍生物為載體的藥物輸送系統(tǒng)的研究提供了更加廣闊的前景。

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[3] 肖延齡,李伯.載藥納米微粒的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].國外醫(yī)學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程分冊,2002,25(4): 174-179.

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R917

B

1671-8194（2013）17-0081-02

國家自然科學(xué)基金（21204036）

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