重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1突變體表達(dá)載體的構(gòu)建

趙 雪 麻馨月

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林，132101）

重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1突變體表達(dá)載體的構(gòu)建

趙 雪 麻馨月

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林 吉林，132101）

目的構(gòu)建重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1突變體的表達(dá)載體。方法采用PCR突變方法，將rhKGF cDNA第40位的Cys密碼子突變?yōu)镾er密碼子，所得的突變片斷插入表達(dá)載體的表達(dá)框架中。結(jié)果DNA測(cè)序分別證實(shí)合成的基因序列克隆入pET-22b中。結(jié)論構(gòu)建重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1突變體的表達(dá)載體，得到突變體蛋白40位絲氨酸突變截短型角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子[Ser40]rhKGFdest-23。

重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子；突變體

角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（Keratinocyte Growth Factor）是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子家族的一員，它通過(guò)與受體（KGFR）的結(jié)合，特異性地刺激上皮細(xì)胞的增殖，對(duì)皮膚、胃、腸、腎、膀胱、肺等上皮的損傷有修復(fù)作用，能減少放化療所帶來(lái)的副作用。KGF能特異性作用于上皮細(xì)胞，而不作用于成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。試驗(yàn)表明，KGF 能加速傷口的重新上皮化[1]、促進(jìn)角膜上皮損傷修復(fù)[2-6]細(xì)胞的損傷[7]，且在燒傷、潰瘍以及切割傷的修復(fù)和再生方面有顯著作用[8，9]。而N端前23位氨基酸殘基缺失后的截短型KGF（KGFdes1-23）具有更高的穩(wěn)定性和活性。KGF是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-7的肝素結(jié)合性家族的一員[10]。

本試驗(yàn)中重組人角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子（rhKGF），是一種通過(guò)DNA重組技術(shù)在大腸桿菌生產(chǎn)的重組人源蛋白。為了增加蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，在去除了內(nèi)源性角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子N-端的前23個(gè)氨基酸，但不影響KGF對(duì)上皮細(xì)胞的促有絲分裂活性基礎(chǔ)上，對(duì)40位游離的半胱氨酸進(jìn)行絲氨酸突變，以期獲得穩(wěn)定性更好，表達(dá)量更高的40位絲氨酸突變截短型角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子[Ser40]rhKGFdest-23突變體蛋白。

1 材料與方法

1.1 材料

限制性內(nèi)切酶，DNA連接試劑盒，質(zhì)粒小提試劑盒，DNA凝膠回收試劑盒，DNA Marker均購(gòu)自Takara公司；Yeast Extract，Typton均購(gòu)自O(shè)XOID；Pyrobest DNA聚合酶，Taq DNA聚合酶，限制性內(nèi)切酶NdeⅠ、BamHⅠ，T4DNA連接酶，Agarose購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；PCR引物由上海生物工程有限公司合成；表達(dá)載體pET-22b，hKGF由暨南大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究開發(fā)中心提供。

1.2 方法

1.2.1 rhKGF1dest23基因片段的合成

設(shè)計(jì)[Ser40]rhKGF1dest23的兩端物，上游引物：5’-GGAATTCCATA TGAGCTATGATTAT-3’（劃線部分為NdeⅠ酶切位點(diǎn)）；下游引物：5’-CGGGGATCCTTATCACGTAATGGCC-3’（劃線部分為BamHⅠ酶切位點(diǎn)）。以pET22b-[Ser40]rhKGF1為模板擴(kuò)增[Ser40]rhKGF1dest-23，經(jīng)94 ℃變性3min進(jìn)入循環(huán)，然后72℃延伸5min，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。把回收產(chǎn)物命名為[Ser40]rhKGFdest-23。它的5’端有NdeⅠ酶切位點(diǎn)，3’端有Bam HⅠ酶切位點(diǎn)。

1.2.2 重組表達(dá)制粒pET22b-[Ser40]rhKGFdest-23的構(gòu)建

重組表達(dá)質(zhì)粒pET22b-[Ser40]rhKGF1dest-23用NdeⅠ和BamHⅠ37℃雙酶切4h，切膠回收后，在SolutionⅠ連接酶的作用下，16℃連接3h后轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α細(xì)胞中，轉(zhuǎn)化菌涂布在含100mg/L Amp平板上，菌落PCR為陽(yáng)性的克隆菌，測(cè)序。

1.2.3 陽(yáng)性菌落的鑒定

酶切完畢后，用PCR Product Purification Kit V3.0進(jìn)行回收。挑選幾個(gè)經(jīng)菌落PCR鑒定呈陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化子，接種到5mL含100μg/mL的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃、220rpm過(guò)夜培養(yǎng)，50%甘油保種。取適量甘油菌測(cè)序，序列測(cè)定由上海生物工程有限公司完成。

2 結(jié) 果

2.1 [Ser40]hKGF1dest23DNA片段的合成，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析，可見約為440 bp的DNA片段(圖1)，與預(yù)期DNA片段大小一致，表明已經(jīng)成功獲得[Ser40]rhKGF1dest23基因。

2.2 轉(zhuǎn)化子的陽(yáng)性鑒定

通過(guò)42℃熱激法將pET22b-[Ser40]rhKGFdest-23重組質(zhì)粒的構(gòu)建和序列分析，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)DH5α中，進(jìn)行菌落PCR鑒定，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在約440 bp見[Ser40]rhKGF1dest23目地條帶，與理論預(yù)期值大小基本一致（圖2），表明已成功構(gòu)建重組表達(dá)載體，重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)北京三博遠(yuǎn)志生物工程有限公司測(cè)序，DNA序列分析確證已成功引入突變，結(jié)果與預(yù)期相符（圖3）。

圖1 上、下游引物及突變體[Ser40]rhKGFdest-23基因片段

圖2 含[Ser40]rhKGF1dest23重組轉(zhuǎn)化子的菌落PCR陽(yáng)性鑒定

3 討 論

圖3 重組載體DNA序列分析

FGF家族對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞與上皮細(xì)胞具有促細(xì)胞增殖與分化的功能，而KGF專一性的與上皮細(xì)胞的FGFRIIIb型受體特異結(jié)合，所以安全性較好。根據(jù)《Protein Science》上的基因結(jié)構(gòu)分析，知h-KGF的40位Cys暴露在分子的表面，易氧化，從而引起h-KGF蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)將重組角質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子-1暴露在分子表面，易引起蛋白不穩(wěn)定的第40位半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸，使其蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。為下一步的突變體蛋白的穩(wěn)定性研究奠定基礎(chǔ)。

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Q507

B

1671-8194（2013）15-0091-02

吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院青年教師科研基金資助項(xiàng)目