野生茄托魯巴姆葉片提取物抑制黃瓜枯萎病菌的提取條件優(yōu)化

李云鵬，趙啟慧，郭鵬康，盧 瀟，虎學(xué)山，娜木日嘎

（黑龍江大學(xué) 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150080）

0 引 言

野生茄托魯巴姆（Solanum torvum）為茄科茄屬植物，其根系發(fā)達，吸收水分、養(yǎng)分能力強，植株生長勢極強，且抗性強，能同時抗4種土傳病害：茄子黃萎病、枯萎病、青枯病、根結(jié)線蟲病，為茄子保護地嫁接栽培中最主要的抗病砧木[1－2]。研究表明，野生茄托魯巴姆葉片粗提物對茄子黃萎病具有較好的室內(nèi)抑菌和盆栽防病效果[3－4]；粗提物對大蔥菌核病菌、辣椒炭疽病菌、茄子黃萎病菌和黃瓜枯萎病菌4種病原真菌的菌絲生長和孢子萌發(fā)的抑制作用均較強[5]。

李云鵬[6]對野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的提取條件做了單因素試驗，認為在幾種常用較高極性提取溶劑中，1∶1乙醇與丙酮為最佳提取溶劑，如果選擇超聲波提取，提取時間以0.5h較好，而在幾種提取方式中，超聲波提取表現(xiàn)出較好的提取效果。正交試驗設(shè)計通過在正交表上安排試驗可以使處理具有均勻分散性，以進行綜合分析比較，達到以較少的試驗次數(shù)得到最佳結(jié)果的目的[7]，因此，通過正交試驗對植物提取物提取條件進行優(yōu)化已成為較常用的方法。然而，目前尚未見通過正交試驗設(shè)計，對野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的提取條件進行優(yōu)化的相關(guān)報道。

本文在前人對野生茄托魯巴姆葉片提取物提取條件研究的基礎(chǔ)上，通過設(shè)定提取溶劑、提取溫度、提取時間、提取次數(shù)4個因素的正交試驗，進行提取物制備，根據(jù)各提取物對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制效果，確定提取物抑菌物質(zhì)的提取工藝。對野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的提取條件進行正交試驗優(yōu)化，可為抑菌物質(zhì)的進一步分離純化提供理論依據(jù)，為野生茄托魯巴姆葉片提取物的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)，也可為其它植物提取物抑菌物質(zhì)的提取條件研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

野生茄葉片材料：種植野生茄托魯巴姆（Solanum torvum），當試材接近成熟期時采集葉片，清洗干凈，于干燥箱內(nèi)60℃烘干，粉碎過40目篩（孔徑0.37mm）備用。

供試菌種：黃瓜枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.cucumarinum）由沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院真菌室提供，在PDA培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)后冰箱冷藏保存，臨用前在PDA培養(yǎng)基上活化。

1.2 試驗儀器

KQ-250B型超聲波清洗器（蘇州江東精密儀器有限公司）、RE-52D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）、SYQ.DSX-280A手提式不銹鋼電熱蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、SW-CJ-2G超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 提取物的制備

稱取粉碎后的植物材料，加入植物干樣重量5倍體積的提取溶劑，以超聲波振蕩提取，雙層定性濾紙抽濾，上清液以相應(yīng)的提取溫度恒溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至干。然后以95%乙醇定容至1g（植物干樣）／mL，作為提取物母液，于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫R用時進行適當稀釋。

1.3.2 正交試驗設(shè)計

為了系統(tǒng)考察野生茄托魯巴姆葉片對黃瓜枯萎病菌抑菌活性物質(zhì)的提取工藝，根據(jù)前人的單因素研究結(jié)果并參考其他植物提取物提取工藝設(shè)計，選取提取溶劑（A）、提取 溫度（B）、提取 時間（C）、提取次數(shù)（D）作為考察因素，各設(shè)3個水平，進行L9（34）正交試驗。各取野生茄托魯巴姆葉片40g，共9份，精密稱量，隨機取樣編號為1～9號，按每個試驗號的要求進行粗提物的制備。以濃度為40g／L提取液進行試驗，以提取物對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑菌直徑為評價指標，篩選最佳提取工藝。因素水平表見表1。

表1 正交試驗的因素和水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.3.3 生長速率法[8]測定提取物對菌絲生長的抑制作用

分別取4mL提取液加入96mL冷卻到50～60℃的滅菌PDA培養(yǎng)基中（提取物濃度為40g／L），混合均勻后倒入直徑為85mm的培養(yǎng)皿中，每處理3次重復(fù)，中央接入直徑為0.722cm的供試菌餅，以95%乙醇為空白對照（CK）。恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)28℃暗培養(yǎng)，觀察菌落大小（根據(jù)對照生長情況確定測定時間），用十字交叉法測定菌落直徑，計算菌落凈生長量和抑菌直徑及抑菌率：

1.3.4 最佳提取條件下不同濃度提取物對菌絲生長的抑制作用

為了驗證正交試驗最佳提取條件下提取物的抑菌效果，在最佳提取條件下進行提取，并將提取物分別稀釋為濃度0.125、0.25、0.5、0.75、1g／mL（提取物終濃度分別為5、10、20、30、40 g／L），按1.3.3的方法測定提取物對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制作用。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

采用Microsoft Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理，用DPS統(tǒng)計軟件以Duncan新復(fù)極差法進行顯著性分析。

2 結(jié)果及分析

2.1 正交試驗及方差分析結(jié)果

由表2可見，RB＞RC＞RA＞RD。由此可知，提取溫度是影響提取效果的重要因素，其次為提取時間和提取溶劑，影響相對較小的因素是提取次數(shù)，說明野生茄托魯巴姆葉片中的抑菌活性物質(zhì)對溫度較敏感。由K值和k值可知，A3優(yōu)于A1和A2，B2優(yōu)于B3和B1，C1優(yōu)于C2和C3，D3優(yōu)于D2和D1。因此初步得出，野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的較好提取條件為A3B2C1D3。

將測得的抑菌直徑進行方差分析（表3），結(jié)果表明，A、B、C、D 4個因素對提取物的抑菌直徑均有極顯著影響。對9個處理進行差異顯著性分析，進一步證明，A3B2C1D3應(yīng)作為最佳提取條件見表4。

表2 正交試驗安排及結(jié)果Table2 Arrangments and results of orthogonal experiments

表3 抑菌直徑方差分析結(jié)果表Table3 Variance analysis based on the inhibitory diameters of mycelial growth

表4 各個處理間差異顯著性Table4 Significance analysis of different treatments

綜上所述，得到野生茄托魯巴姆葉片抑菌物質(zhì)的最佳提取條件為以石油醚為提取溶劑，采用30℃超聲波提取3次，每次提取15min。

2.2 最佳提取條件下提取物的抑菌活性

不同濃度最佳提取條件下提取物的抑菌作用見圖1，由圖1可見，隨著提取物濃度的增加，對黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑制作用呈增強趨勢，但濃度為20～40g／L時不同濃度提取物的抑菌作用相差不大，抑制率均＞70%。

圖1 不同濃度提取物對黃瓜枯萎病菌的抑制作用Fig.1 Inhibition of extracts from different concentration on Fusarium oxysporumf.sp.cucumarinum

3 討 論

在進行植物提取物提取條件研究時，通常是在單因素試驗基礎(chǔ)上，通過正交試驗進行提取條件優(yōu)化，以確定具體提取物的提取工藝。利用正交試驗研究提取物的最佳提取工藝的相關(guān)報道較多，彭友舜等[9]研究了蘆筍莖中多糖的提取工藝，得到了超聲波輔助提取筍莖多糖的最佳提取條件；楊曉帆等[10]得到了魔芋總生物堿的最佳提取條件為料液比1∶12，乙醇濃度85%，索氏提取4h；馬麗娟等[11]研究表明，從蛇床子中提取抑制黃瓜枯萎菌的活性成分以在室溫下95%乙醇連續(xù)超聲提取3次，每次45min為宜。本試驗表明，野生茄托魯巴姆葉片中抑制黃瓜枯萎病菌菌絲生長的抑菌活性物質(zhì)的最佳提取條件為以石油醚為提取溶劑，采用30℃超聲波提取3次，每次提取15min。其中，提取溶劑的研究結(jié)果與李云鵬[6]對野生茄托魯巴姆葉片抑制茄子黃萎病菌抑菌物質(zhì)提取條件的單因素研究結(jié)果存在較大差異，可能與使用的靶標菌不同有關(guān)，也可能是受提取條件各因子間互作效應(yīng)的影響。

本文以黃瓜枯萎病菌為供試菌種，研究了野生茄托魯巴姆葉片抑菌活性物質(zhì)的提取條件，由于同一提取物對不同病原真菌的抑菌效果可能不同[12]，即抑制一種病原真菌的抑菌活性物質(zhì)可能對另一種病原真菌沒有抑制作用。所以本試驗結(jié)果對其它植物病原真菌是否同樣適用，尚需進一步驗證。

本試驗表明，野生茄托魯巴姆葉片的石油醚提取物中具有較強抑制黃瓜枯萎病菌的抑菌活性物質(zhì)，可據(jù)此對提取物抑菌活性物質(zhì)進行進一步分離純化，以期獲得抑菌物質(zhì)純品，同時可進行野生茄托魯巴姆葉片石油醚提取物抑制黃瓜枯萎病的盆栽試驗，以期為該提取物的應(yīng)用提供更確鑿的依據(jù)。

[1]杜曉榮，潘紹坤.野生茄托魯巴姆成都地區(qū)露地繁種技術(shù) [J].長江蔬菜，2008，（8）：33-34.

[2]徐本美，孫運濤，駱 明，等.茄子砧木——托魯巴姆種子催芽劑的研究 [J].種子，2001，（4）：77-78.

[3]李之璞，周寶利，李云鵬.利用野生茄提取物控制栽培茄子黃萎病的研究 [J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，（2）：34-35.

[4]李云鵬，周寶利，李之璞，等.野生抗病茄植株腐解物對茄子黃萎病的調(diào)控研究 [J].植物保護，2007，33（3）：50-52.

[5]李云鵬，尹玉玲，趙 宏，等.野生茄托魯巴姆葉片提取物對園藝作物病原真菌的抑菌活性 [J].中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（4）：120-124.

[6]李云鵬.野生茄對茄子黃萎病菌的化感作用及利用研究 [M].哈爾濱：黑龍江大學(xué)出版社，2009：40-49，53.

[7]鄧振偉，于 萍，陳 玲.SPSS軟件在正交試驗設(shè)計、結(jié)果分析中的應(yīng)用 [J].電腦學(xué)習(xí)，2009，（5）：15-17.

[8]方中達.植病研究方法 [M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：151-154.

[9]彭友舜，宋士濤，廉 琪，等.超聲波輔助提取蘆筍莖中多糖工藝的優(yōu)化 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（5）：2645-2646.

[10]楊曉帆，王 紅，王 芳，等.魔芋總生物堿量的測定 [J].光譜實驗室，2011，28（1）：153-156.

[11]馬麗娟，周寶利，張淑紅，等.蛇床子提取物對黃瓜枯萎病菌抑制效果的研究 [J].植物保護，2008，34（4）：36-39.

[12]Qasem J R and Abu-blan.Antifungal activity of aqueous extracrs from some common weed species [J].Application Biology，1996，128：533-540.