葡萄全汁乳酸發(fā)酵菌株篩選及其風(fēng)味分析

林曉姿, 梁璋成, 魏 巍, 李維新, 任香蕓, 何志剛,*

(1.福建省農(nóng)科院農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究所,福建福州 350003;2.福建省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品加工研究中心,福建福州 350013)

乳酸菌發(fā)酵果蔬汁在日美等發(fā)達(dá)國(guó)家已有部分產(chǎn)品研發(fā)成功[1],但國(guó)內(nèi)僅有以花甘藍(lán)、胡蘿卜、甜菜、南瓜、番茄等果蔬為原料的實(shí)驗(yàn)室研究報(bào)道[2-4],未見(jiàn)葡萄汁乳酸發(fā)酵的研究,也鮮見(jiàn)乳酸發(fā)酵果汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的國(guó)內(nèi)外相關(guān)報(bào)道.要在較高酸度的全果汁中實(shí)現(xiàn)乳酸發(fā)酵,就要求所用乳酸菌能適應(yīng)酸性環(huán)境并快速增殖,發(fā)酵產(chǎn)生的滋味與風(fēng)味能與果汁物性協(xié)調(diào).現(xiàn)有研究多直接應(yīng)用乳制品發(fā)酵常用菌種,往往需在原料或擴(kuò)大培養(yǎng)基中添加一定量乳粉來(lái)啟動(dòng)乳酸發(fā)酵[4-5],或者僅限于中性或弱酸性發(fā)酵基質(zhì),產(chǎn)生的滋味與果汁清爽淡雅風(fēng)格不協(xié)調(diào),無(wú)法提升果汁飲料風(fēng)味及營(yíng)養(yǎng)功能.“桂葡1號(hào)”葡萄是適宜南方栽培的優(yōu)良加工品種[6],但其果汁酸度較高,可達(dá)0.5% ～1.2%,本實(shí)驗(yàn)室在針對(duì)枇杷果汁乳酸發(fā)酵菌株篩選等前期研究基礎(chǔ)上[7-8],篩選適宜葡萄果汁乳酸發(fā)酵的優(yōu)良菌株,研究?jī)?yōu)選菌的單菌及復(fù)配發(fā)酵對(duì)果汁風(fēng)味物質(zhì)的影響,旨在為南方特色果品的精深加工提供新領(lǐng)域及技術(shù)支撐,為飲料市場(chǎng)提供具有功能因子的新型益生菌發(fā)酵產(chǎn)品.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 葡萄果汁

“桂葡1號(hào)”葡萄,福建省福安產(chǎn),果實(shí)經(jīng)去梗、破碎、護(hù)色、取汁,分裝在玻璃發(fā)酵瓶中加硅膠塞于沸水浴殺菌10 min,冷卻備用.果汁總酸(以酒石酸計(jì))0.60%,pH值3.32,可溶性總糖(以葡萄糖計(jì))19.93%.

1.1.2 乳酸菌

干酪乳桿菌20986、嗜熱鏈球菌20379,購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心;植物乳桿菌R23(Lactobacillus plantarum R23)、干酪乳桿菌R35(Lactobacillus casei R35)[7]、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37(Lactobacillus paracasei R37),本實(shí)驗(yàn)室選育并保藏.各菌株的培養(yǎng)及發(fā)酵溫度均為28±1℃.

1.1.3 LH16 培養(yǎng)基[8]

用于乳酸菌的液體保藏.TJA培養(yǎng)基:番茄汁50 mL,酵母抽提液5 g,牛肉膏10 g,乳糖20 g,葡萄糖2 g,磷酸氫二鉀2 g,吐溫80 1g,乙酸鈉5 g,加蒸餾水至1 L,pH值為6.8±0.2,121℃下滅菌20 min,用于活菌的平板計(jì)數(shù).

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備

供試乳酸菌經(jīng)活化后,分別接種于液體培養(yǎng)基LH16,培養(yǎng) 24 h后至菌量達(dá)109CFU/mL,采用3000 r/min、4℃離心10 min,取菌坭加適量預(yù)處理葡萄汁振蕩懸浮,菌密度達(dá)到109CFU/mL以上,待用.

1.2.2 乳酸菌的耐酸性實(shí)驗(yàn)

將1.2.1收集的乳酸菌菌坭用無(wú)菌生理鹽水洗滌2次,并以原體積的十分之一制成懸浮菌,以1%的接種量分別接種于pH值為2.5,3.0,3.5的LH18培養(yǎng)基中,28±1℃控溫培養(yǎng)4 h,每2 h取樣進(jìn)行活菌計(jì)數(shù),平行3次取平均值.

1.2.3 葡萄全汁乳酸發(fā)酵風(fēng)味評(píng)價(jià)方法

將1.2.1制備的種子液,分別以107CFU/mL的生物量接入葡萄果汁中,28℃控溫培養(yǎng),感官評(píng)判發(fā)酵風(fēng)味變化.

1.2.4 目標(biāo)菌株共生發(fā)酵

將植物乳桿菌R23、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37按1.2.1制備種子液,分別將2株單菌株,以及2菌株按接種體積比1∶1復(fù)配菌,按107CFU/mL的生物量接入葡萄全汁中,28±1℃控溫培養(yǎng),每12 h檢測(cè)發(fā)酵果汁菌體生物量.

1.2.5 目標(biāo)菌株發(fā)酵風(fēng)味評(píng)判與組分測(cè)定

將1.2.1制備的種子液,分別以107CFU/mL的生物量接入葡萄汁中,28±1℃控溫培養(yǎng),以未發(fā)酵葡萄果汁為對(duì)照,選取發(fā)酵風(fēng)味最佳時(shí)期進(jìn)行感官評(píng)判,并定性檢測(cè)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì).

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 風(fēng)味評(píng)判[7,9]

從果香、發(fā)酵香、滋味和典型性四個(gè)角度來(lái)考察,分別賦予20分,40分,20分,20分的權(quán)重,最后以各項(xiàng)的總和加權(quán)計(jì)算.請(qǐng)12個(gè)經(jīng)培訓(xùn)過(guò)的專(zhuān)業(yè)人士進(jìn)行獨(dú)立打分,取平均值統(tǒng)計(jì)分析.發(fā)酵樣品按其得分分為5級(jí).一級(jí)為90～100分,特點(diǎn)為有葡萄果香,發(fā)酵香濃郁,滋味好,風(fēng)格獨(dú)特,優(yōu)雅無(wú)缺;二級(jí)為80～89分,特點(diǎn)為有葡萄果香,發(fā)酵香較濃郁,滋味好,典型明確,風(fēng)格良好;三級(jí)為70～79分,特點(diǎn)為有葡萄果香,發(fā)酵香一般,滋味較好,有典型性,不夠怡雅;四級(jí)為60～69分,特點(diǎn)為葡萄果香淡,發(fā)酵香不明顯;五級(jí)分值小于60分,特點(diǎn)為香氣及滋味均不愉快.

1.3.2 菌落總數(shù)測(cè)定

參照GB/T 4789.35—2003[食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)—乳酸菌飲料中乳酸菌檢驗(yàn)],平板菌落計(jì)數(shù)法.

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)測(cè)定

參考文獻(xiàn)[10]方法改進(jìn).

1)樣品前處理.取200 mL樣品,分別用100,50,30 mL的重蒸2遍的二氯甲烷萃取3次,合并有機(jī)相,用無(wú)水硫酸鈉脫水干燥,濃縮至5 mL,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 mL,-40℃保存.

2)檢測(cè)條件.采用Agilent 7980A/5975C型氣質(zhì)聯(lián)用系統(tǒng),色譜柱HP-FFAP(改性聚乙二醇柱,極性)30 m×0.25 m×0.25 mm.色譜條件:載氣He氣,進(jìn)樣口溫度250℃,柱溫采用程序升溫,60℃保留5 min,以5℃/min升至240℃,保留10 min恒流(1 mL/min),不分流進(jìn)樣.質(zhì)譜條件:離子源溫度為230℃,四級(jí)桿溫度為150℃,電離方式為EI源.

1.4 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,數(shù)據(jù)采用DPS軟件處理,表1是3次實(shí)驗(yàn)的平均值,數(shù)據(jù)以x±s表示;圖1至圖4及表2是其中一次典型實(shí)驗(yàn)的測(cè)定和評(píng)價(jià)值,樣品中各未知揮發(fā)性成分經(jīng)NIST08譜庫(kù)檢索定性,定量分析采用面積歸一法.

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌的耐酸能力比較

各菌株耐酸能力見(jiàn)表1.植物乳桿菌R23、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37和干酪乳桿菌R35均能在pH值3.0的環(huán)境下維持生長(zhǎng),其中R23和R37在pH值2.5的環(huán)境下培養(yǎng)4 h的生物量仍高于105CFU/mL,顯著高于其他各菌(P＜0.01).干酪乳桿菌20986在pH值為2.5的環(huán)境下培養(yǎng)4 h后生長(zhǎng)受限,而嗜熱鏈球菌20379則全部死亡.結(jié)果表明,植物乳桿菌R23和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37對(duì)高酸環(huán)境的耐受能力最強(qiáng),適用于較高酸度果蔬汁的乳酸發(fā)酵.

表1 菌株耐酸能力對(duì)比Tab.1 Comparison of acid tolerance capacity among strains lgCFU/mL

2.2 乳酸菌發(fā)酵風(fēng)味的比較

葡萄果汁接種不同乳酸菌控溫培養(yǎng)過(guò)程的發(fā)酵風(fēng)味變化見(jiàn)圖1.不同發(fā)酵菌株均能賦予發(fā)酵基質(zhì)典型性的發(fā)酵香氣,參考陶永勝等[11]對(duì)葡萄酒香氣特征描述,感官評(píng)價(jià)認(rèn)為植物乳桿菌R23含有淡雅綿長(zhǎng)的白脫香,副干酪乳桿菌副干酪亞種R37賦予典型性突出的樹(shù)脂香,均與葡萄果香協(xié)調(diào),分別在發(fā)酵2 d和3 d獲得最佳發(fā)酵風(fēng)味,風(fēng)味值可達(dá)93～94分.嗜熱鏈球菌20379可能是因?yàn)閷?duì)pH值為3.32葡萄全汁的高酸抗逆性較差,生長(zhǎng)受到抑制,無(wú)法產(chǎn)生良好發(fā)酵風(fēng)味,干酪乳桿菌 R35、干酪乳桿菌20986則產(chǎn)生了奶臭味或腐土味等與葡萄果香不協(xié)調(diào)的風(fēng)味.

圖1 葡萄全汁乳酸發(fā)酵風(fēng)味評(píng)判Fig.1 Evaluation of flavor of lactic acid fermented grape juice

耐酸實(shí)驗(yàn)(表1)和風(fēng)味評(píng)價(jià)(圖1)結(jié)果表明,植物乳桿菌R23和副干酪乳桿菌副干酪亞種R37應(yīng)用于葡萄果汁發(fā)酵,可生產(chǎn)與葡萄果香協(xié)調(diào)的愉快發(fā)酵香,是葡萄果汁乳酸發(fā)酵的優(yōu)良菌株.

2.3 優(yōu)選菌株復(fù)配發(fā)酵生長(zhǎng)模型

植物乳桿菌 R23、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37的單菌株及其復(fù)配菌在葡萄果汁中的生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖2.兩菌株及復(fù)配菌在葡萄果汁中均能快速進(jìn)入對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期,生長(zhǎng)穩(wěn)定期可維持120 h以上,生長(zhǎng)曲線均符合Gauss模型.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:兩菌株復(fù)配在葡萄汁中可共生發(fā)酵,其菌量對(duì)數(shù)值Y與發(fā)酵時(shí)間X的回歸方程為:Y=8.948 2×(1-0.205 279×EXP(-0.003 087×X2)(F=193.208 6,P＜0.01).

圖2 優(yōu)選菌株的生長(zhǎng)曲線Fig.2 Growth carve of capable strains

2.4 優(yōu)選菌株風(fēng)味評(píng)價(jià)

植物乳桿菌 R23、副干酪乳桿菌副干酪亞種R37的單菌株及其復(fù)配菌的發(fā)酵風(fēng)味評(píng)分見(jiàn)圖3,最佳風(fēng)味收獲期的風(fēng)味值達(dá)93～96分,復(fù)合菌發(fā)酵糅合了兩單菌特點(diǎn)而更顯愉快飽滿,且與果香協(xié)調(diào).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:復(fù)配菌在葡萄汁中的發(fā)酵風(fēng)味集合了兩菌株各自特點(diǎn)而更具優(yōu)勢(shì),具有理想應(yīng)用前景.

圖3 優(yōu)選菌株及其配伍菌的發(fā)酵風(fēng)味Fig.3 Fermentation flavor of capable strains and their symbiosis

2.5 發(fā)酵菌株對(duì)揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的影響

采用GC-MS法定性檢測(cè)發(fā)酵及未發(fā)酵葡萄果汁揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的總離子流色譜圖見(jiàn)圖4,結(jié)果見(jiàn)表2.葡萄果汁以酯類(lèi)和芳香族物質(zhì)為主,乳酸發(fā)酵主要增加了酸、酮、酯類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量比例,酚和酸有新增的組分.植物乳桿菌R23發(fā)酵產(chǎn)生的風(fēng)味物質(zhì)數(shù)量最多,各單株發(fā)酵及其復(fù)合菌發(fā)酵所產(chǎn)生的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成不同,形成各具特色的發(fā)酵風(fēng)味,其主要特征風(fēng)味物質(zhì)的定性定量分析鑒定待另文發(fā)表.

圖4 葡萄乳酸發(fā)酵果汁GC-MS總離子流色譜Fig.4 Total ion contents of volatile components emitted from lactic acid fermented grape juice by GC-MS

表2 葡萄乳酸發(fā)酵果汁中的主要揮發(fā)性成分含量Tab.2 Relative contents of volatile components emitted from lactic acid fermented grape juice

3 結(jié)論與討論

大部分水果的物性都偏酸,尤其是南方特色果品枇杷、葡萄等果汁的pH值往往低于4.0,有機(jī)酸豐富,而乳糖等碳源缺乏.現(xiàn)有研究多直接應(yīng)用酸奶發(fā)酵菌,添加乳粉或者人為降低果汁酸度,以啟動(dòng)乳酸發(fā)酵,但破壞了果汁的自然風(fēng)味與滋味.本實(shí)驗(yàn)室自選的植物乳桿菌R23與副干酪乳桿菌副干酪亞種R37均是MLF乳酸菌,具有耐酸能力好,可利用天然有機(jī)酸為碳源,發(fā)酵香與原果香協(xié)調(diào),增殖能力強(qiáng)[12]等優(yōu)點(diǎn),可獲得樹(shù)脂香型或淡雅白脫香的自然清爽乳酸發(fā)酵果汁,均是葡萄果汁乳酸發(fā)酵適宜菌株.

不同乳酸菌發(fā)酵果汁產(chǎn)生的發(fā)酵風(fēng)味和滋味存在差異,能形成與原果香協(xié)調(diào)的發(fā)酵香的乳酸菌才是適宜發(fā)酵菌株.植物乳桿菌R23與副干酪乳桿菌R37能改變葡萄果汁的風(fēng)味物質(zhì)組成,促進(jìn)果汁風(fēng)味復(fù)雜性的形成,兩菌株復(fù)配發(fā)酵是友好共生型,風(fēng)味與單菌發(fā)酵各有特色,可通過(guò)優(yōu)化復(fù)配比例得到更理想的發(fā)酵風(fēng)味.

乳酸發(fā)酵改變了果汁所含酸、酮、酯類(lèi)等物質(zhì)組成及其成分?jǐn)?shù)量[9],形成了復(fù)雜多樣的風(fēng)味和滋味體系[13],可通過(guò)定性定量鑒定其特征代謝產(chǎn)物建立相應(yīng)的指紋圖譜,為乳酸發(fā)酵果汁新產(chǎn)品提供真、假、偽、劣的鑒定依據(jù).

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