花生分離蛋白復合酶水解工藝優(yōu)化研究

許均華, 李高陽,2,*

(1.中南大學隆平分院,湖南長沙 410125;2.湖南省農產品加工研究所,湖南長沙 410125)

用花生分離蛋白制備抗氧化活性肽的方法很多,制備途徑主要有酸堿水解法、生物合成法、微生物發(fā)酵法、酶解法[1-5].因為酶解法價格低廉,易進行、易控制、易分離,安全性高而受到廣泛關注[6].由于花生分離蛋白分子結構致密,且蛋白酶具有底物專一性[7],為了得到較好的水解效果,采用復合酶進行水解在實際生產中具有現(xiàn)實意義.

目前,蛋白功能肽的開發(fā)已成為一個研究熱點[1-4],但花生分離蛋白肽研究很少.本研究探討不同蛋白酶其最適酶解條件下的水解能力,比較其清除DPPH自由基能力和水解度(DH)的相關性,確定復合酶的組成.根據酶水解原理和響應面統(tǒng)計法研究花生分離蛋白酶水解制備抗氧化肽,為花生分離蛋白開發(fā)利用提供參考.

1 材料與儀器

1.1 材料

花生分離蛋白,實驗室自制.堿性蛋白酶Alcalase、固體木瓜蛋白酶Papain(S)、中性蛋白酶Neutrase、風味蛋白酶Flavorzyme、胃蛋白酶、胰蛋白酶均為食品級,丹麥諾維信有限公司;二苯基苦基苯肼(DPPH)自由基 ,分析純,Sigma有限公司;石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、甲醛等均為國產分析純試劑.

1.2 主要儀器與設備

HH-S26型恒溫水浴鍋,北京科偉永興儀器有限公司;Avanti J-26 XP型冷凍離心機,美國貝克曼有限公司;7750031 Free Zone型4.5L冷凍干燥機 ,美國Labconco有限公司;UV-1700型紫外可見分光光度計,日本島津分析儀器廠;Delta 320型pH酸度計 ,瑞士梅特勒-托利多集團.

1.3 實驗方法

1.3.1 水解度的測定

水解度(degree of hydrolysis,DH)測定方法同參考文獻[8].

1.3.2 DPPH自由基清除率的測定

測定方法同參考文獻[8].

1.3.3 花生分離蛋白的制備方法

測定方法同參考文獻[8].

1.3.4 花生分離蛋白酶水解物的制備

配制適量質量濃度(W/V)的花生分離蛋白溶液,用0.1 moL/L NaOH溶液調節(jié)蛋白溶液pH值至預定值,再選用復合蛋白酶分別在其最適的條件下酶解花生分離蛋白.在酶反應器中,及時加入NaOH溶液維持pH值不變.水解一定時間后,調pH值為4.5,95℃加熱10 min滅酶.4 000 r/min離心15 min,所得上清液即為花生分離蛋白水解液.

1.3.5 蛋白酶的篩選

選用堿性蛋白酶(alcalase)、中性蛋白酶(neutrase)、固體木瓜蛋白酶(papain)、胰蛋白酶(parenzyme)、胃蛋白酶(pepsin)等5種蛋白酶在其各自最優(yōu)條件下對花生分離蛋白進行水解,以DPPH自由基清除率和DH為指標,篩選出清除率和DH都比較理想的兩到三種蛋白酶進行后續(xù)復配實驗.

進行復配實驗時,選取兩到三種酶制劑進行復合酶篩選實驗,蛋白底物濃度為(W/V)5%,復配比例為1∶1(酶添加量),酶添加總量為3%,在各酶水解最適條件下,水解3 h.

1.3.6 復合酶比例的確定

經過前期預實驗可知,酶解約束條件為底物質量濃度(W/V)5%,酶添加總量3%,水解溫度55℃,水解pH 8.0,水解3 h,設定9個不同水平的復配比例,研究效果較好的兩種酶制劑之間量的不同配比對花生分離蛋白蛋白酶解效果的影響.同時以胰蛋白酶和堿性蛋白酶在同等條件下的花生分離蛋白水解液作為對照,確定堿性蛋白酶和胰蛋白酶的最佳復合酶比例.

1.3.7 復合蛋白酶組合風味蛋白酶水解條件篩選

對比單酶和復合酶的水解效果:經過前期預實驗可知,確定復合酶(堿性酶+胰酶)水解粗略的適宜水解條件為底物質量濃度(W/V)為5%,酶添加總量(E/S)為3%,水解溫度55℃,水解pH值8.0,水解180 min,以DPPH清除率,DH為指標,改變風味蛋白酶添加時間、酶解時間、酶量、pH值、溫度中的一個參數,分別測定其清除率和水解度,確定風味蛋白酶的較佳單因素條件.

1.3.8 響應面分析試驗

實驗重復次3次,結果表示為平均數±標準偏差.在單因素實驗結果的基礎上,選取pH值(X1)、溫度(X2)、酶添加總量(X3)和酶解時間(X4)4個主要因素,以酶解液的DPPH自由基清除率為響應值,通過 Design Expert 8.0.4軟件,根據 Box-Benhnken試驗設計原理,設計了四因素三水平共29組實驗(其中有5次為重復的中心點,用于估計實驗誤差)對預處理工藝進行響應面分析,求出數學模型,得到較佳工藝參數.因素水平編碼表見表1.

表1 試驗因素水平編碼表Tab.1 Coded levels of variables of response surface design

1.4 數據統(tǒng)計分析

單因素所得數據采用Excel處理,響應面試驗所得數據采用SAS與STATISTIC統(tǒng)計軟件分析.

2 結果與討論

2.1 花生分離抗氧化肽粉的組成分析

通過實驗測定了花生抗氧化肽粉組成成分的質量百分比,并與原花生分離蛋白成分質量百分比進行比較,具體數據見表2.花生抗氧化肽粉中的蛋白質質量比比花生分離蛋白的要少(蛋白質質量比從原來蛋白中的70.13%下降到肽粉中13.87%),而氮溶指數(TCA-NSI)質量比從花生分離蛋白中的12.51%上升到79.43%.由此可知,花生分離蛋白的短肽得率比較高,酶解效果好.

表2 花生抗氧化肽粉的組成Tab.2 Main components of peanut antioxidant peptide

2.2 單蛋白酶的篩選結果

選取6種不同的蛋白酶在其最適的溫度、pH值下對花生分離蛋白進行水解,比較其水解度和清除率可知,無論是從DPPH清除率還是水解度進行考察,Alcalase堿性蛋白酶的酶解效果都較好,其次是胰蛋白酶及木瓜蛋白酶.這3個蛋白酶中有兩種蛋白酶(Alcalase堿性蛋白酶、胰蛋白酶)感官品質表現(xiàn)出淡黃、澄清,而木瓜蛋白酶是微黃,有部分沉淀.結果見表3.

表3 不同蛋白酶對花生分離蛋白的酶解條件及酶解結果Tab.3 Enzymatic condition and results of hydrolysis of peanut protein isolate with different proteases

2.3 復合蛋白酶篩選結果

選取前期單酶實驗酶解效果較好的3種蛋白酶(Alcalase堿性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶)進行兩兩組合實驗,并跟單酶實驗進行對比,結果見圖1.由圖1可知,堿性蛋白酶和胰蛋白酶組合酶解效果最好.因此,選取這個組合作為后續(xù)實驗的復合酶.

2.4 復合蛋白酶比例組合篩選結果

選取堿性蛋白酶和胰蛋白酶作為本次實驗的復合蛋白酶,配制不同比例的復合酶,以水解度和清除率作為指標,從而得出較佳的復合酶比例.實驗數據見表4,8號處理組的水解度和清除率最高,分別達到18.95%,73.49%,比第二高的7組分別提高了0.19%,0.48%.與單一酶解效果比較,復合酶中1至9號所有處理組合的水解度和清除率均高于單一胰蛋白酶處理組,而單一堿性蛋白酶要高于復合酶2,3,4,5,6處理組.所以本實驗采用的復合酶比例是第8處理組(8∶2).

表4 堿性蛋白酶和胰蛋白酶不同復合比例組合對花生分離蛋白的水解效果Tab.4 Enzymatic results of hydrolysis of peanut protein isolate with combined alcalase and trypsin at different ratios

2.5 復合蛋白酶與風味蛋白酶水解花生分離蛋白的單因素實驗結果

在復合酶確定的前提下,影響花生分離蛋白的清除率和DH的主要因素有反應溫度、pH值、時間和酶添加量等,因而單因素實驗分別討論了這幾個因素對酶解效果的影響.

2.5.1 風味蛋白酶加入量的選擇

在一定條件下,加入復合蛋白酶,30 min后再加入風味蛋白酶.隨著風味蛋白酶量的增加,DH和DPPH清除率先增大后減小,結果見圖2,當風味蛋白酶加入量(E/S)為2%時,花生分離蛋白水解效果較佳.

圖2 風味蛋白酶加入量對花生分離蛋白水解效果的影響Fig.2 Effect of flavorzyme amount on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

2.5.2 風味蛋白酶加入時間的選擇

在一定條件下,復合蛋白酶加入量(E/S)為2%,再隔一定時間加入風味蛋白酶.隨著加入風味蛋白酶時間的增加,DPPH清除率先減小后增大,而DH一直下降最后趨于平穩(wěn),結果見圖3.當風味蛋白酶加入時間為30 min時,花生分離蛋白水解效果較佳.

圖3 風味蛋白酶加入時間對花生分離蛋白水解效果的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on DH and DPPH free radicals scavenging with flavorzyme

2.5.3 復合蛋白酶水解時間的選擇

根據前面實驗,固定風味蛋白酶的酶解條件(加入量為2%,加入時間為30 min),以復合酶粗略的酶解條件為基礎,改變其中的酶解時間,選擇8個時間段分別考察清除率和水解度兩個指標,酶解開始30 min后加入風味蛋白酶,結果見圖4.

圖4 時間對花生分離蛋白水解效果的影響Fig.4 Effect of hydrolysis time on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

由圖4可見,酶解液的水解度和清除率均隨酶解時間的延長而逐漸增加,酶解最初2 h增長速度極快直至3 h,4～5 h后反應逐漸趨于平緩,7～8 h的時間段里水解度的增長不大,基本持平,而清除率呈下降趨勢.因此,選擇水解時間3 h為宜.隨著反應產物的增多,酶和底物的有效碰撞減少,系統(tǒng)的pH值也發(fā)生了變化,加之酶的活性逐漸下降,反應后期水解度的變化不大.清除率在酶解前期隨著酶解時間增大逐漸增大,反應后期,活性肽可能被進一步水解,喪失了氧化活性,造成了清除率的下降.

2.5.4 復合蛋白酶水解pH值的選擇

根據實驗1.3.7,固定風味蛋白酶的酶解條件(加入量2%,加入時間30 min),以復合酶粗略的酶解條件為基礎,酶解時間3 h,選擇8個不同pH值考察清除率和水解度.分別調整酶解液pH值為6.0,6.5,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,反應時間3 h.pH值為6～7時,酶解液的水解度和清除率增長率都達到最高,pH值為7.0～8.5時,增長比較平緩,從pH值為8.5開始,水解度和清除率急速下降.根據實際情況,選取pH值8.5為宜,結果見圖5.

2.5.5 復合蛋白酶水解溫度的選擇

取樣分別用不同酶解溫度進行水解,酶解液在50℃時水解度和清除率最高,水解度為25.3%,清除率為77.9%.55℃之后隨著溫度的繼續(xù)升高水解度和清除率快速下降,這說明隨著反應溫度的提高,酶的活性降低,蛋白質轉化率下降,結果見圖6.

2.5.6 復合蛋白酶加酶總量的選擇

在確定酶解溫度、pH值、酶解時間的基礎上,考察6個加酶量對水解度和清除率的影響,在酶促反應中,底物濃度已達到使酶飽和的狀態(tài),其反應速度將隨酶濃度的變化而變化[9].加酶總量(E/S)在3%時,水解度最高,添加量為1% ～2%的反應體系中底物充足,速度較快,添加量在4%以后趨緩,這時酶與酶之間相互水解,酶有效利用率下降,故選加酶總量為3%,結果見圖7.

圖5 pH值對花生分離蛋白水解效果的影響Fig.5 Effect of pH on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

圖6 溫度對花生分離蛋白水解效果的影響Fig.6 Effect of hydrolysis temperature on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

圖7 加酶總量對花生分離蛋白水解效果的影響Fig.7 Effect of enzyme/substrate ratio(E/S)on DH and DPPH free radicals scavenging of peanut protein isolate

2.6 較佳復合蛋白酶酶解條件的探討

在復合蛋白酶水解花生分離蛋白的反應體系中,參數有加酶總量、酶解時間、pH值、水解溫度,采用DPPH自由基清除率(Y1)和水解度(Y2)為優(yōu)化指標.

2.6.1 試驗設計及響應值

綜合考慮各因素對清除率和水解度的影響,采用Box-Benhnken試驗設計原理[10],對溫度、反應時間、pH值、加酶總量4因素優(yōu)化設計,結果如表5.

表5 Box-Benhnken試驗設計與試驗結果Tab.5 Experimental design and results of Box-Benhnken experimental design

2.6.2 酶解過程各參數對清除率的回歸模型

為了考察各因素對復合蛋白酶清除率的影響,以DPPH清除率為考察指標,利用分析軟件(DESIGN EXPERT 7.0)對表5的試驗結果進行分析,以pH值(X1)、水解溫度(X2)、復合酶添加總量(X3)和酶解時間(X4)為自變量,DPPH自由基清除率(Y1)為因變量,建立酶解工藝參數回歸模型,回歸方程為:清除率=79.63+1.37X1-2.16X2+3.86X3-0.30X4+0.67X1X2-0.15X1X3-0.063X1X4+1.87X2X3+0.45X2X4+1.25X3X4-1.08-0.79-4.43-0.63

對回歸模型進行方差分析,結果見表6.

表6 復合蛋白酶清除率方差分析Tab.6 ANOVA for free radical scavenging rate of hydrolyzed peanut protein isolate with different technological parameters

從表6可以看出,清除率的回歸模型具有高度顯著性(P＜0.000 1),失擬項P=0.114 8＞0.05,不顯著.為0.917 4,說明該模型能解釋約92%響應值的變化,表明方程擬合程度較好.本試驗CV=1.48%,表明試驗結果可靠,在可接受范圍之內,可以用此模型分析和預測復合酶水解花生分離蛋白各因素對清除率的影響.

根據回歸方程系數顯著性檢驗可知,模型的一次項 X1、X2、X3(P＜0.01)影響極顯著,X4(P＞0.05)影響不顯著;交互項X2X3(P＜0.01)影響極顯著,X1X3(P＜0.05)影響顯著;二次項(P＜0.05)影響顯著,(P＜0.01)影響都極顯著,、影響不顯著.由此可以看出,響應值的變化復雜,各個因素對響應值的影響不是簡單的線性關系.由表6中F值的大小可以判斷各因素對清除率影響的強弱.由此可知影響因素的主效應主次順序為酶添加總量＞水解溫度＞pH值＞水解時間.

2.6.3 酶解過程各參數對水解度的回歸模型

為了考察各因素對復合蛋白酶清除率的影響,以DH為考察指標,利用分析軟件(DESIGN EXPERT 7.0)對表5的試驗結果進行分析,以pH值(X1)、水解溫度(X2)、復合酶添加總量(X3)和酶解時間(X4)為自變量,水解度DH(Y2)為因變量,建立酶解工藝參數回歸模型.回歸方程為:DH=25.29-0.39X1+0.24X2-0.40X3+1.39X4-0.29X1X2+0.54X1X3+0.47X1X4-0.18X2X3-0.21X2X4+1.95X3X4-1.15-0.30-0.47-3.16.

對回歸模型進行方差分析,結果見表7.DH的回歸模型具有高度顯著性(P＜0.000 1),失擬項P=0.068 4＞0.05,不顯著.為 0.884 5,表明方程擬合程度較好.本試驗CV=3.12%,表明試驗結果可靠,在可接受范圍之內,可以用此模型分析和預測復合酶水解花生分離蛋白各因素對DH的影響.

根據回歸方程系數顯著性檢驗可知,模型的一次項 X4(P ＜0.01)影響極顯著,X1、X2、X3(P ＞0.05)影響不顯著;交互項X3X4(P＜0.01)影響極顯著;二次項、、(P＜0.01)影響都極顯著,影響不顯著.由此可以看出,響應值的變化復雜,各個因素對響應值的影響不是簡單的線性關系.由表8中F值的大小可以判斷各因素對水解度影響的強弱.由此可知影響因素的主效應主次順序為水解時間＞酶添加總量＞pH值＞水解溫度.

2.6.4 花生分離蛋白清除率和DH相關分析研究

經過spss統(tǒng)計軟件對Y1(清除率)和Y2(DH)之間進行相關線性分析,進一步研究清除率和DH之間的線性相關性,從而確定花生分離蛋白抗氧化性肽的影響指標,試驗結果見表8.

從表8可以看出,模型(P=0.167＞0.05)不顯著,表明Y1(清除率)和Y2(DH)之間線性不相關,即清除率大水解度不一定大,水解度大的清除率也不一定大.

表7 花生分離蛋白水解度回歸模型方差分析Tab.7 ANOVA for DH of hydrolyzed peanut protein isolate with different technological parameters

表8 清除率與DH線性相關方差分析結果Tab.8 ANOVA for linear correlation between DH of peanut protein isolate and DPPH free radical scavenging rate

為了進一步研究清除率與水解度之間的相關性,在復合蛋白酶制備花生分離蛋白抗氧化性肽較佳酶解條件下,每隔0.5 h測定一次清除率和DH(每個數據為3次平行試驗均值),畫出酶解10 h過程中清除率和DH之間的變化趨勢圖,試驗結果見圖8.從圖8可看出,清除率達到最大時DH并沒達到最大值,DH先急劇上升后慢慢趨于平緩,最終保持不變.而酶解產物的清除率是先上升到最大值后呈急速下降態(tài)勢,酶解產物的清除率和DH在前3 h內具有相關性,即在酶解過程前3 h時之內,清除率隨著DH值的增大而增大.3 h后,水解度基本保持不變,而清除率急劇下降,8 h后趨于平緩,且這段時間兩者線性不相關.因此制備花生分離蛋白抗氧化性肽以清除率為第一響應指標,水解度(DH)為輔助指標,這樣可以制備到清除率最高的抗氧化性肽.

圖8 清除率和水解度的變化趨勢Fig.8 Changes of DH of peanut protein isolate and DPPH free radical scavenging rate

2.7 工藝參數的驗證

通過軟件對回歸模型進行數學統(tǒng)計分析,可得到兩個最大響應值所對應的因素條件,見表9.從表中可知,達到最大清除率和DH的因素條件并不完全一致,線性不相關,表明兩個指標之間相互制約.結合前面清除率和DH之間的變化趨勢圖的分析并綜合考慮可知,優(yōu)化酶解條件為:pH 8.5、溫度49.36℃、酶添加量3.40%、酶解時間203.59 min.采用上述優(yōu)化轉變后的酶解工藝條件,并且進行3次平行的驗證實驗,測得花生分離蛋白抗氧化肽對DPPH自由基的清除率為80.58%、DH為24.40%.通過與理論值(表10中花生分離蛋白自由基清除率為80.18%和 DH為24.59%)比較,誤差都在±1%以內.說明采用響應面法優(yōu)化得到的酶解工藝條件參數準確可靠,根據建立的模型進行預測實踐是可行的.

表9 基于試驗編碼值的優(yōu)化條件轉化Tab.9 Translation of experimental code to real value of optimum conditions

表10 酶解平行驗證試驗結果Tab.10 Validation results of optimized peanut protein isolate hydrolysis process

3 結 論

1)通過比較研究堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、風味蛋白酶等5種蛋白酶的水解效果,根據DPPH自由基清除率和水解度兩個指標選取出堿性蛋白酶和胰蛋白在酶添加量比例為8∶2時做為復酶配合使用,并且風味蛋白酶在水解開始30 min后添加酶量2%,酶解效果俱佳.

2)采用Design Expert 8.0.4統(tǒng)計分析軟件進行響應面分析,建立復合蛋白酶酶解花生分離蛋白工藝中pH值、酶解溫度、加酶總量和酶解時間對DPPH自由基清除率和水解度的數學模型.通過方差和可信度分析表明,模型擬合度較好.

3)在較佳條件下復合蛋白酶制備花生分離蛋白抗氧化肽過程中,酶解產物的清除率與水解度在一定范圍內呈正或負相關,即在酶解3 h內清除率隨著水解度增大而增大,6 h后隨著水解度增加清除率反而降低.

4)復合蛋白酶制備花生分離蛋白抗氧化肽的較佳酶解工藝為pH 8.5、溫度49.36℃、酶添加量3.40%、酶解時間203.59 min.采用優(yōu)化后的酶解工藝條件,進行3次平行的驗證實驗,測得花生分離蛋白抗氧化肽對DPPH自由基的清除率為80.58%,DH為24.40%.

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