簡(jiǎn)并引物法克隆保加利亞乳桿菌β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因

崔文明, 劉 鷺, 張書文, 逄曉陽(yáng), 李紅娟, 呂加平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工綜合性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193)

β-N-乙酰氨基己糖苷酶(β-N-Acetylhexosaminidase，β-Hexcase)是在細(xì)菌、植物和動(dòng)物中廣泛存在的一種多糖水解酶，可以催化切除β-N-乙酰氨基己糖的非還原性氨基己糖殘基，在細(xì)胞的正常分裂增殖中起著重要作用[1-3].正常細(xì)菌分裂增殖過程中，肽聚糖水解酶作用于細(xì)胞壁從而實(shí)現(xiàn)母代細(xì)胞與子代細(xì)胞分離.而當(dāng)正常的調(diào)控失衡時(shí)，肽聚糖水解酶則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的自溶[4].

保加利亞乳桿菌LJJ是本實(shí)驗(yàn)室從傳統(tǒng)乳制品中分離得到的一株乳酸菌，該菌種在乳制品發(fā)酵過程中表現(xiàn)出較強(qiáng)的自溶特性，而在乳制品的發(fā)酵過程中，發(fā)酵劑的自溶并不總是有利的[5].因此，為了有效地調(diào)控乳酸菌的自溶性，擬對(duì)其自溶的發(fā)生機(jī)理進(jìn)行研究.已有的研究結(jié)果表明肽聚糖水解酶在乳酸菌自溶過程中起著重要作用[6-7].

本研究選擇iCODEHOP[8]在線軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物用于β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因片段的克隆.鑒于CODEHOP的諸多優(yōu)點(diǎn)[8-10]，迄今為止，利用此方法已成功擴(kuò)增出了鵝[11]、多種細(xì)菌[12-13]、人[14]、植物[15]、動(dòng)物[16]等生物體中的多種未知基因序列片段.選擇iCODEHOP在線軟件設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增克隆保加利亞乳桿菌LJJ的β-N-乙酰氨基己糖苷酶，可有效地保證目的基因片段的獲取，為后續(xù)熒光定量RTPCR研究其在乳酸菌自溶過程中的作用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要數(shù)據(jù)庫(kù)和生物軟件

NCBI、BlockMaker(http:∥ blocks.fhcrc.org/blocks/makeblocks.html或 http:∥blocks.fhcrc.org/blockmkr/makeblocks.html)、CodeHop(http:∥blocks.fhcrc.org/blocks/codehop.html)、clustalW2(http:∥www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.html)、iCodeHop(http:∥dbmi-icode-01.dbmi.pitt.edu/i-codehop-context/Welcome).

1.1.2 菌株與質(zhì)粒

德式乳桿菌保加利亞亞種(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)LJJ，本實(shí)驗(yàn)室-20℃冰箱保存;大腸桿菌 DH5α，北京天根生化公司;質(zhì)粒pGET-T，美國(guó)Promega公司.

1.1.3 試劑

細(xì)菌基因組提取試劑盒、2×Bench TopTMTaq Master Mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒，美國(guó)Biomiga公司;克隆試劑盒，美國(guó)Promega公司;引物合成，北京華大基因公司.

1.2 儀器設(shè)備

TP600型梯度PCR儀，日本Takara株式會(huì)社;FluorChem FC2型凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)Alpha Innotech公司;DYY-6C型電泳儀，北京六一儀器公司;DL-CJ-IN型高性能無菌試驗(yàn)臺(tái)，哈爾濱市東聯(lián)公司;DHP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;LDZX-50KB型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠.

1.3 方法

1.3.1 簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)及篩選

從NCBI蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中，查找已知相應(yīng)菌種N-乙酰氨基己糖苷酶的氨基酸序列.通過16S rDNA查找比對(duì)選取親緣關(guān)系較近、同源性較高菌種的N-乙酰氨基己糖苷酶的氨基酸序列，分別為:Lactobacillusdelbrueckiisubsp.lactisDSM 20072 GB_EGD27790.1，Lactobacillus amylovorusGRL 1112，YP_004031587.1，Lactobacillus suebicusKCTC 3549，ZP_09451258.1，Lactobacillus salivariusUCC118，YP_536455.1，LactobacilluskefiranofaciensZW3，YP_004563601.1，選上述氨基酸序列以FASTA格式保存.

利用iCODEHOP程序設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物的步驟如下:1)進(jìn)入在線主頁(yè)選擇開始一個(gè)non-named或者named session;2)選擇引物設(shè)計(jì)(Design Primers)選項(xiàng)，選擇上傳提交(SUBMIT)本地以FASTA保存的上述序列;3)選擇“進(jìn)行分析”(Proceed with analysis)選項(xiàng).程序顯示通過Clustal W2對(duì)這些氨基酸進(jìn)行多序列比對(duì)，選擇SUBMIT生成比對(duì)結(jié)果.并可以進(jìn)化樹的形式表示這些氨基酸的關(guān)系遠(yuǎn)近，命名比對(duì)結(jié)果后，選擇 Proceed，獲得保守區(qū)(block)，本實(shí)驗(yàn)共得到6個(gè)保守區(qū).4)簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì).設(shè)置引物主要參數(shù)為:遺傳密碼(Genetic code)standard，其余參數(shù)均采用默認(rèn)設(shè)置;簡(jiǎn)并度(Degeneracy)128(默認(rèn));退火溫度 (Temperature)為60.0℃(默認(rèn));精密度(strictness)為0.0(默認(rèn))，選擇“找尋引物”(Look for primers).5)簡(jiǎn)并引物的篩選.頁(yè)面顯示所有符合條件的引物以箭頭表示，并按照保守區(qū)的順序以字母表順序排列.點(diǎn)擊相應(yīng)箭頭即顯示其對(duì)應(yīng)氨基酸序列，依據(jù)得到的引物得分(Clamp score)及簡(jiǎn)并度(Core degeneracy)情況選擇引物 .引物得分應(yīng)越高越好，簡(jiǎn)并度應(yīng)越小越好.

1.3.2 簡(jiǎn)并引物擴(kuò)增N-乙酰氨基己糖苷酶基因

依照Biomiga細(xì)菌組DNA提取試劑盒中操作提取細(xì)菌總DNA，用設(shè)計(jì)篩選的簡(jiǎn)并引物進(jìn)行擴(kuò)增.

PCR反應(yīng)體系為 20 μL:2×Bench TopTMTaq Master Mix，10 μL，上游引物為 20 μmol，1 μL，下游引物為 20 μmol，1 μL，DNA 模板，5 ng，加 ddH2O 補(bǔ)至20 μL.PCR 反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性，5 min，然后94℃變性30 s，60℃至50℃間退火，72℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min.

1.3.3 PCR產(chǎn)物的檢測(cè)、鑒定、回收、克隆及測(cè)序

采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物.采用北京天根生化公司的凝膠回收試劑盒回收目的片段.克隆步驟參見Promega公司的pGEM-T試劑盒說明書所述方法.膠回收DNA片段與pGEM-T載體在4℃連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，37℃培養(yǎng)14～16 h，挑選6個(gè)白色菌落溶于10 μL ddH2O中，以此為 DNA模板，以RV-M 和M13-47通用引物進(jìn)行菌落PCR鑒定，將陽(yáng)性克隆送至華大基因進(jìn)行測(cè)序.

2 結(jié)果與分析

2.1 篩選得到的簡(jiǎn)并引物

綜合考慮不同引物對(duì)的引物簡(jiǎn)并度，引物得分及引物退火溫度情況，選取引物對(duì)Hex1-f，Hex1-r和Hex2-f，Hex2-r作為擴(kuò)增β-Hecase基因的簡(jiǎn)并引物.引物具體序列如表1.預(yù)計(jì)兩引物對(duì)所擴(kuò)增產(chǎn)物大小約為620 bp.

表1 N-乙酰氨基己糖苷酶的簡(jiǎn)并引物Tab.1 Degenerate primer sequences of β-Hexcase

2.2 簡(jiǎn)并引物PCR擴(kuò)增結(jié)果

分別以 Hex1-f，Hex1-r和 Hex2-f，Hex2-r作為上下游引物，以LJJ基因組DNA為模板，經(jīng)梯度PCR擴(kuò)增.由圖1可知，引物對(duì)Hex1-f，Hex1-r在約600 bp處獲得清晰明亮的產(chǎn)物條帶，與目的產(chǎn)物片段大小一致.此時(shí)在大于1 500 bp處亦存在較模糊的條帶，而隨著退火溫度提高到60℃，條帶開始變得模糊，這主要是由于簡(jiǎn)并引物具有一定的簡(jiǎn)并性，存在擴(kuò)增出其他非特異性片段的可能性.退火溫度較低時(shí)，由于引物特異性有所降低，這一現(xiàn)象表現(xiàn)得較為嚴(yán)重，該非特異性產(chǎn)物經(jīng)目的條帶的凝膠回收分離后將不會(huì)影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果[17-19].

圖1 簡(jiǎn)并引物梯度PCR擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)果Fig.1 Result of CODEHOP by gradient PCR

2.3 簡(jiǎn)并引物PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定

菌液PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖2.以所挑選的6個(gè)白色菌落菌液為模板，經(jīng)載體通用引物擴(kuò)增6個(gè)陽(yáng)性克隆的菌液PCR均在略大于600 bp處得到清晰明亮的特異性產(chǎn)物條帶，產(chǎn)物大小與插入目的基因片段大小一致.

圖2 TA克隆陽(yáng)性克隆的菌液PCR瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR amplification of positive cloning

2.4 PCR產(chǎn)物的測(cè)序及序列比對(duì)

選取兩個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示，簡(jiǎn)并引物PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度為614 bp，詳細(xì)序列如下:AACTGGCCAGCCTTTTCCTAATCGACAGCACTGGCGA TTTTACTGAAAACCTCCGACTTTTGGAGCAGTACCAG CCAGCCGGCCTCCTACTCTTTGCCAAAGACCTGGCGG GCCTAAGCGAAAAGGCTGTTAAAGAGCGGCTGGCGA TTTACCGGCAGGCCCGGCCAGGTTTGCTGCTCGCCAT TGACCAGGAAGGCGGCTTAGTCAGCCGCTTGTCCACC CTTTACCCAAACCGGTCTTACCCCAGCCAAGCTGAAC TTTTGAAAAAGGGGGCTGACTTTTTCTTAGCAGAAAA CCAAAAGACGGCCCTGAAATTAAAAGATTTAGGCAT CAACTTGAACTTTGCTCCGGTGGCTGATCTTGCGCTT GATCCGGCCAGTTTCATCTACAGCCGGACCCTGCAAG CAGGAGCTGAGGAAACCGGGCCGGCAATCGCGGCCT TTATCAAGCTCTACCGGCAGCTGGGAGTCGCCTCCTG CGCCAAGCATTTTCCTGGCTACGGGGATGCCGGCGAC ACCCACCAGGCTCCGGCTAAAGACCTTAGAAGCCTTA AAGAAGCCCAGCTGGATCTTTTACCTTTTAAAGCTGC GATCGCGGCGAGCGTGCCGACTATC

簡(jiǎn)并引物預(yù)測(cè)的產(chǎn)物長(zhǎng)度約為620 bp，而實(shí)際測(cè)序得到的產(chǎn)物長(zhǎng)度為614 bp.可能是在去除載體序列時(shí)多去掉了幾個(gè)堿基造成的，但測(cè)序結(jié)果與預(yù)測(cè)產(chǎn)物長(zhǎng)度基本一致.如表2所示，擴(kuò)增物序列的blastx比對(duì)結(jié)果顯示，LJJ與L.delbrueckiisubsp.lactisDSM 20072中β-N-乙酰氨基己糖苷酶的一致性最高，而與Lactobacillus suebicusKCTC 3549中β-N-乙酰氨基己糖苷酶的一致性最低，其一致性仍達(dá)到40%.因此，可以證明該擴(kuò)增片段確為L(zhǎng)JJ中β-N-Acetylhexosaminidase的部分基因片段.

表2 簡(jiǎn)并引物Hex1-f，Hex1-r擴(kuò)增序列的blastx比對(duì)結(jié)果Tab.2 Blastx results of amplified sequence with degenerate primer Hex1-f and Hex1-r

3 結(jié) 論

利用iCODEHOP在線簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)得到的簡(jiǎn)并引物對(duì)Hex1-f和Hex1-r，可以從保加利亞乳桿菌LJJ中擴(kuò)增得到大小為614 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)TA克隆測(cè)序，blastx比對(duì)驗(yàn)證其為β-N-乙酰氨基己糖苷酶部分基因片段.β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因的獲得為下一步采用熒光定量RT-PCR分析β-N-乙酰氨基己糖苷酶基因在LJJ自溶的變化調(diào)控創(chuàng)造了條件.

LJJ β-N-乙酰氨基己糖苷酶保守基因片段的成功克隆證明由已知親緣關(guān)系較近的同源物種的已知基因序列，利用iCODEHOP簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)的簡(jiǎn)并引物可有效地?cái)U(kuò)增克隆得到目的物種的基因序列片段，從而為未知基因片段的獲取提供高效便捷的途徑.

[1] Slámová K， Bojarová P， Gerstorferová D， et al.Sequencing， cloning and high-yield expression of a fungal β-N-acetylhexosaminidase inPichia pastoris[J].Protein Expression and Purification，2012，82:212217.

[2] Slámová K， Bojarová P， Petrásková L， et al. β-NAcetylhexosaminidase:What's in a name...?[J].Biotechnology Advances， 2010， 28:682693.

[3] Masahiro Ogawa， Mai Kitagawa， Hideharu Tanaka， et al.A β-N-acetylhexosaminidase from Symbiobacterium thermophilum gene cloning， overexpression， purification and characterization[J].Enzyme and Microbial Technology，2006，38:457464.

[4] Uehara T， Parzych K R， Dinh T， et al.Daughter cell separation is controlled by cytokinetic ring-activated cell wall hydrolysis[J].EMBO Journal， 2010， 29:1412-1422.

[5] Chopin A，Bolotin A，Sorokin A，et al.Analysis of six prophages inLactococcus lactisIL1403 different genetic structure of temperate and virulent phage populations[J].Nucleic Acids Research，2001， 29:644 -651.

[6] Bernard E， Rolain T， Courtin P， et al.Characterization of O-Acetylation of N-Acetylglucosamine a novel structural bariation of bacterial peptidoglycan[J].Journal of Biological Chemistry， 2011， 286:23950 -23958.

[7] Atsushi Furukawa， Kumiko Nakadi-Tsukui， Tomoyoshi Nozaki.Novel transmembrane receptor involved in phagosome transport of lysozymes and b-hexosaminidase in the enteric protozoanEntamoeba histolytica[J].PLoS Pathogens， 2012， 8:115.

[8] Boyce1 R，Chilana P，Rose T M.iCODEHOP a new interactive program for designing consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers from multiply aligned protein sequences[J].Nucleic Acids Research，2009，37:222 -228.

[9] Rose T M，Schultz E R，Henikoff J G，et al.Consensusdegenerate hybrid oligonucleotide primers for amplification of distantly related sequences[J].Nucleic Acids Research，1998，26:1628 -1635.

[10] 高安崇，史旭升，孫永峰，等.鵝CAT4基因的簡(jiǎn)并引物設(shè)計(jì)及克隆[J].中國(guó)家禽，2010，32(12):15-19.

[11] 逄曉陽(yáng)，刑鑫，劉國(guó)文，等.用CODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆反芻月形單胞菌K6乙酸激酶基因片段[J].中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2010，30(1):102106.

[12] 任南琪，林海龍，李建政，等.用CODEHOP設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆B49乙酸激酶基因片段[J].哈爾濱工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，39(8):1226 -1230.

[13] 李夏，袁建軍，盧英華，等.簡(jiǎn)并PCR法克隆L.starkeyi蘋果酸酶基因[J].泉州師范學(xué)院學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2010，28(2):59-62.

[14] 姜晶，孫穎，劉紅艷，等.人免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因引物設(shè)計(jì)方法的改良[J].微生物學(xué)雜志，2012，32(2):6063.

[15] 智強(qiáng)，李淑慧，高利宏，等.利用簡(jiǎn)并PCR克隆煙草節(jié)桿菌02181肌酸酶基因[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007(12):6568.

[16] 侯林，李楠，伊男，等.中國(guó)鹵蟲早期胚胎發(fā)育相關(guān)基因的研究—Orthodenticle基因克隆中簡(jiǎn)并引物的設(shè)計(jì)和優(yōu)化[J].遼寧師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版，2009，32(1):99101.

[17] Chen M，Liu H L，Bai Y F，et al.Homologous-restraint polymerase Chain reaction:an efficient and rapid protocol to clone multiple homologous genes[J].Current Microbiology， 2008， 57:51-54.

[18] Zlateva K T，Crusio K M，Leontobich A M，et al.Design and validation of consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers for broad and sensitive detection of corona-and toroviruses[J].Journal of Virological Methods， 2011， 177:174183.

[19] Acevedo J P， Reyes F， Parra L P， et al.Cloning of complete genes for novel hydrolytic enzymes from Antarctic sea water bacteria by use of an improved genome walking technique[J].Journal of Biotechnology， 2008，13:277286.