SAA在鼻咽癌CNE-2細胞中的表達及其對細胞生長、凋亡的影響

江青山，鄧文蓉，肖桃源，沈?qū)氒?/p>

(南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院，湖南衡陽421001)

血清淀粉樣蛋白A(SAA)是由肝細胞合成及分泌的急性期炎癥性蛋白，正常情況下在人體內(nèi)表達水平較低，一旦發(fā)生炎癥、感染及損傷時，其表達水平可在短時間內(nèi)增加1 000倍左右［1］。新近研究發(fā)現(xiàn)，人類某些腫瘤組織也能表達SAA蛋白，且在不同器官及組織的惡性腫瘤發(fā)展過程中，SAA蛋白的血清水平均明顯升高［2］。研究顯示，SAA的信使RNA及蛋白都是由腫瘤細胞產(chǎn)生的，并且作為一種小的碎片積聚于細胞膜或細胞質(zhì)上［3］。SAA與受體FPR2結(jié)合后可促進嗜中性粒細胞產(chǎn)生抑制抵抗腫瘤細胞免疫的IL-10，從而促進腫瘤細胞生長［4］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，SAA低表達可抑制鼻咽癌CNE-2細胞的生長。2012年9月～2013年4月，本實驗進一步構(gòu)建SAA表達載體，瞬時轉(zhuǎn)染鼻咽癌CNE-2細胞，檢測其對鼻咽癌CNE-2細胞生長及凋亡的影響。

1 材料與方法

1．1 材料 鼻咽癌CNE-2細胞購于中南大學(xué)湘雅中心實驗室細胞庫。1640培養(yǎng)基購于Hyclone公司、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購于美國Invitrogen公司、鼠抗人SAA一抗購于SantaCruz公司、羊抗鼠二抗來自ICL公司進口分裝、MTT粉及Hoechst33258熒光染色試劑盒購于碧云天生物技術(shù)研究所。

1．2 方法

1．2．1 siRNA序列的設(shè)計及構(gòu)建 設(shè)計3組SAA基因的shRNA表達干擾載體、1組陰性對照序列，分別命名為 pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-147、pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-270、pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482、pGPU6/GFP/Neo-shNC。干擾基因片段的序列以及設(shè)計的RNAi寡核苷酸的正義序列和反義序列如表1所示。上述載體均由上海吉瑪公司設(shè)計及構(gòu)建。

1．2．2 實驗分組及鼻咽癌CNE-2細胞的轉(zhuǎn)染 siRNA實驗干擾組:分別轉(zhuǎn)染3組SAA基因的shRNA表達干擾載體;脂質(zhì)體對照組:轉(zhuǎn)染等量的脂質(zhì)體;空白組:未添加任何干擾因素;SAA增高組:轉(zhuǎn)染pCD3．1(+)-SAA質(zhì)粒(由課題組中獲得)。陽性對照組取對數(shù)期、生長良好的鼻咽癌CNE-2細胞按需求種于孔板內(nèi)，測量質(zhì)粒的濃度，按LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進行轉(zhuǎn)染。

表1 SAA基因干擾片段的序列以及RNAi正義序列和反義序列

1．2．3 RT-PCR篩選鼻咽癌CNE-2細胞中SAA的表達 PCR引物序列:SAA基因:上游細胞引物序列(5'-3'):CGCGGATCCGCATACAGCCATACCATTCTGA，下游引物序列(5'-3'):CCGCTCGAGTACCCTCTCCCCGCTTTGT，產(chǎn)物大小501 bp;內(nèi)參GAPDH基因:上游引物序列(5'-3'):GGATTTGGTCGTATTGGGCG，下游引物序列(5'-3'):CCTGGAAGATGGTGATGGGATT，產(chǎn)物大小208 bp。

設(shè)計3組干擾實驗組、脂質(zhì)體對照組、空白組、陰性對照組，分別取鼻咽癌CNE-2細胞接種于6孔板內(nèi)進行轉(zhuǎn)染。48 h后，提取各組細胞的總RNA并定量，逆轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后進行PCR，RT-PCR產(chǎn)物于100 mV恒壓下進行1%瓊脂糖凝膠電泳，于紫外線下采用AlphaImager2200圖像分析系統(tǒng)分析目的條帶。

1．2．4 Western-blotting篩選鼻咽癌 CNE-2細胞中SAA的表達 設(shè)計3組干擾實驗組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、空白組、陰性對照組。分別取鼻咽癌CNE-2細胞接種于6孔板內(nèi)進行轉(zhuǎn)染。48 h后，提取各組細胞的總蛋白，并予以配平后進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉;鼠抗人 SAA 一抗1∶200、內(nèi)參GAPDH 1∶2 000室溫孵育過夜;TBST洗膜3次，羊抗鼠二抗1∶2 000室溫孵育2 h;TBST洗膜，DAB顯影，拍照，采用FR200圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1．2．5 RT-PCR 及 Western-blotting檢測鼻咽癌CNE-2細胞中SAA的表達 設(shè)計最佳干擾實驗組、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組、空白組、陰性對照組、SAA增高組。分別于6孔板細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)染，檢測方法同1．2．3和 1．2．4。

1．2．6 MTT檢測鼻咽癌CNE-2細胞增殖率 設(shè)計最佳shRNA表達干擾載體組、脂質(zhì)體對照組、空白組、陰性對照組、SAA增高組。分別取鼻咽癌CNE-2細胞接種于96孔板內(nèi)進行轉(zhuǎn)染。于12、24、36、48、60、72 h 6個時間點每孔加入 20 μL MTT 溶液(濃度5 mg/mL)，37℃繼續(xù)培育4 h，棄孔內(nèi)液體并加入150μL DMSO，低速搖晃10 min后于波長490 nm的酶聯(lián)免疫吸附儀中測各孔吸光度值。

1．2．7 Hoechst33258熒光染色檢測鼻咽癌CNE-2細胞增殖率 設(shè)計最佳shRNA表達干擾載體組、脂質(zhì)體對照組、空白組、陰性對照組、SAA增高組。分別取鼻咽癌CNE-2細胞接種于12孔板細胞內(nèi)進行轉(zhuǎn)染。24 h后洗滌、固定、染色，熒光顯微鏡下觀察及拍照。

1．2．8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17．0統(tǒng)計軟件，計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 鼻咽癌CNE-2細胞SAA siRNA轉(zhuǎn)染結(jié)果 于熒光顯微鏡下觀察鼻咽癌CNE-2細胞的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率約為70%，細胞形態(tài)呈長梭形，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后細胞形態(tài)未見明顯改變。

2．2 siRNA對鼻咽癌CNE-2細胞中SAA mRNA和蛋白的沉默作用 轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR、Westernblotting檢測結(jié)果顯示，pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482干擾實驗組中SAA mRNA和蛋白表達水平最低，沉默作用最佳(P均＜0．05);各組鼻咽癌CNE-2細胞中SAA mRNA和蛋白表達水平比較見表2。

表2 siRNA對鼻咽癌CNE-2細胞SAA mRNA和蛋白的沉默作用(ˉx±s)

2．3 鼻咽癌CNE-2細胞中SAA mRNA和蛋白的表達 轉(zhuǎn)染48 h后，RT-PCR、Western-blotting檢測結(jié)果顯示，SAA mRNA和蛋白在 pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482干擾實驗組中低表達，在SAA增高組中高表達，其與對照組的SAA mRNA表達水平基本一致。各組鼻咽癌CNE-2細胞中SAA mRNA和蛋白表達水平比較見表3。

表3 鼻咽癌CNE-2細胞中SAA mRNA和蛋白的沉默作用(ˉx ± s)

2．4 SAA基因?qū)Ρ茄拾〤NE-2細胞生長的影響在 12、24、36、48、60、72 h 6 個時間點，pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482干擾實驗組轉(zhuǎn)染的鼻咽癌CNE-2細胞生長速度最慢，SAA增高組生長速度最快?？瞻捉M、脂質(zhì)體對照組以及陰性對照組未見明顯變化。見表4。

表4 各組不同時間點CNE-2細胞增殖率比較(ˉx±s)

2．5 SAA基因?qū)Ρ茄拾〤NE-2細胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染24 h進行Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡下可見活細胞核呈彌散均勻淡藍色熒光，凋亡細胞核呈濃染致密的顆粒狀、固縮狀亮藍色熒光。其中pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482干擾實驗組轉(zhuǎn)染的鼻咽癌CNE-2細胞凋亡程度最高，SAA增高組凋亡程度最低，其余3組鼻咽癌CNE-2細胞凋亡程度基本一致。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染后鼻咽癌CNE-2的細胞凋亡熒光染色圖

3 討論

SAA是由一簇多基因編碼的多形性蛋白家族，目前共發(fā)現(xiàn)4種構(gòu)成SAA的基因［1］。SAA蛋白不僅是炎癥信號促發(fā)劑，而且是新型腫瘤標志物，在胃癌［5］、口腔癌［6］、乳腺癌［7］等惡性腫瘤患者血清中的表達均有上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)，SAA mRNA和SAA蛋白在卵巢良性細胞、交界性細胞、原發(fā)性癌細胞、轉(zhuǎn)移性癌細胞中的表達水平逐漸增高，且SAA1和SAA4基因在卵巢癌細胞中存在過度表達［8］。SAA mRNA和SAA蛋白在頭頸鱗狀細胞癌中的表達水平明顯高于正常黏膜［9］。在信號通路領(lǐng)域內(nèi)的研究發(fā)現(xiàn)，SAA含有RGD樣黏附結(jié)構(gòu)和一些在結(jié)構(gòu)和功能上與細胞外基質(zhì)蛋白類似的結(jié)構(gòu)，能夠影響細胞黏附、轉(zhuǎn)移和增殖，從而參與腫瘤發(fā)展進程［10］。Mullan等［11，12］發(fā)現(xiàn)，SAA 在炎癥狀態(tài)下可以誘導(dǎo)血管生成和基質(zhì)金屬蛋白酶表達，這兩者是公認的腫瘤生長和侵犯周圍組織的重要成分。Preciado-Patt等［13］發(fā)現(xiàn)，SAA-ECM復(fù)合物能夠促進人類T淋巴細胞分泌TNF-α，從而促進腫瘤細胞生長。Michaeli等［14］認為，SAA能夠促進纖溶酶原的激活，而纖溶酶原的激活在炎癥和腫瘤的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。上述研究表明SAA與腫瘤及其腫瘤細胞的發(fā)展具有一定的相關(guān)性，且可能占據(jù)重要地位。本實驗通過構(gòu)建SAA表達載體，沉默及過表達SAA基因來研究SAA基因的表達對鼻咽癌CNE-2細胞生長及凋亡的影響。

本實驗采用瞬時RNA干擾技術(shù)，針對SAA基因構(gòu)建了3組SAA shRNA表達干擾載體，瞬時轉(zhuǎn)染至鼻咽癌CNE-2細胞中以沉默SAA基因，繼而篩選出最佳沉默載體。結(jié)果顯示，pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482、pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-147干擾實驗組均能干擾鼻咽癌 CNE-2細胞中SAA mRNA及蛋白的表達，但 pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482干擾實驗組SAA mRNA及蛋白表達最低，干擾效果最佳。而 pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-270干擾實驗組與空白組、陰性對照組、脂質(zhì)體對照組相比未見明顯下降，故選定 pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482干擾實驗組作為有效干擾組。在成功檢測pGPU6/GFP/Neo-SAA1-homo-482干擾組與本課題中提供的SAA增高組能夠沉默及過表達SAA基因后，經(jīng)MTT法及Hoechst33258染色發(fā)現(xiàn)，SAA基因過表達可促進鼻咽癌CNE-2細胞生長，低表達可促進其凋亡。提示SAA基因表達與鼻咽癌細胞的增殖具有一定的相關(guān)性。

綜上所述，本研究篩選出了能夠有效沉默SAA表達的siRNA序列，并發(fā)現(xiàn)SAA表達越高，鼻咽癌CNE-2細胞生長越快，反之凋亡越快。SAA蛋白與鼻咽癌CNE-2細胞生長具有一定的相關(guān)性。關(guān)于SAA基因的生理機制及其在鼻咽癌中的作用目前尚不清楚，有待進一步深入研究。

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