酒精性肝病患者血清瘦素及其受體基因Gln223Arg多態(tài)性變化

曾俊濤，陳 靜

(海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，海口570102)

瘦素(Lep)是一種具有調(diào)節(jié)脂肪與能量平衡的內(nèi)分泌激素，其水平與肝硬化、糖尿病發(fā)病有關(guān)。Lep和瘦素受體(LEPR)結(jié)合發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)［1］。LEPR基因Gln223Arg變異，可能影響LEPR的結(jié)合活性，使Lep-LEPR的功能異常，引起Lep抵抗［2］。有研究顯示，Lep抵抗可導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性，促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生［3］，但Lep、LEPR基因多態(tài)性是否參與酒精性肝硬化的發(fā)病過(guò)程尚不完全清楚。2008年6月～2013年2月，我們對(duì)酒精性肝硬化患者的血清Lep水平及LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)和分析，探討其與酒精性肝硬化的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1．1 臨床資料 選擇海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院收治的酒精性肝病患者106例，參照《酒精性肝病診療指南》［4］:酒精性脂肪性肝炎患者45例(AH組)，年齡(43．42 ±5．07)歲，BMI為 22．16 ±2．15;酒精性肝硬化患者61例(AC組)，年齡(44．95±4．13)歲，BMI為22．48±2．46。選擇同期健康體檢者65例作為對(duì)照組，年齡(43．11 ±6．14)歲，BMI為 21．74±1．91。研究對(duì)象均為男性，3組年齡、BMI均具有可比性(P均 ＞0．05)。

1．2 方法

1．2．1 血清Lep和胰島素抵抗(IR)指數(shù)檢測(cè) 禁食8～12 h，清晨抽空腹靜脈血，離心分離血清。采用ELISA法檢測(cè)血清Lep，葡萄糖氧化酶—過(guò)氧化物酶法檢測(cè)空腹血糖(FPG)，化學(xué)發(fā)光免疫分析法檢測(cè)空腹血清胰島素(FINS)。IR指數(shù)采用HOMA模式計(jì)算，HOMA-IR=FPG ×FINS/22．5。

1．2．2 LEPR基因 Gln223Arg多態(tài)性檢測(cè) 采用PCR-RFLP法。嚴(yán)格按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行DNA制備。PCR引物序列:上游引物:5'-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG-3'，下 游引物:5'-AGCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT-3'，擴(kuò)增長(zhǎng)度:421 bp。反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;94℃變性、55℃退火及72℃延伸各1 min，共35個(gè)循環(huán);終末72℃延伸7 min。聚合酶鏈反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)20 g/L瓊脂糖凝膠確認(rèn)。PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶MspⅠ內(nèi)切，37℃孵育6 h，在20 g/L瓊脂糖凝膠上，4 V/cm電泳1 h左右，紫外燈下觀測(cè)結(jié)果［5］。

1．2．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS12．0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。Lep與HOMA-IR的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P≤0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 3組血清 Lep、HOMA-IR比較 見(jiàn)表1。AH組、AC組血清Lep與HOMA-IR均呈正相關(guān)(r分別為0．45、0．38，P 均 ＜0．01)。

表1 3 組血清 Lep、HOMA-IR 比較(ˉx ±s)

2．2 3組LEPR Gln223Arg基因型比較 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物可被MspⅠ酶解為2個(gè)片段，294 bp條帶及127 bp條帶。Gln223純合子(AA)電泳帶型為421 bp條帶;Arg223純合子(GG)電泳帶型為294 bp條帶及127 bp條帶;Gln223Arg/Arg223雜合子(A/G)電泳帶型為421 bp條帶、294 bp條帶及127 bp條帶。見(jiàn)圖1。AH組AA、A/G、GG的例數(shù)分別為3、11、31例，AC 組分別為 0、25、36例，對(duì)照組分別為 1、12、52例;AH組與對(duì)照組、AC組比較，P均＞0．05;AC組與對(duì)照組比較，P ＜0．05。

圖1 LEPR基因Gln223Arg電泳結(jié)果

3 討論

Lep是肥胖基因編碼的一種由167個(gè)氨基酸組成的分泌蛋白，通過(guò)與LEPR結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)進(jìn)食、能量消耗、糖代謝平衡等作用［6］。有研究顯示，Lep水平、LEPR Gln223Arg等位基因的變異可能與肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)［7］。Lep是體內(nèi)與脂肪代謝密切相關(guān)的激素之一，Lep、胰島素、游離脂肪酸之間相互作用涉及整個(gè)脂肪—胰島素軸的平衡狀態(tài)［8］。血清中Lep水平的增高可以抑制神經(jīng)肽Y基因表達(dá)，導(dǎo)致攝入減少，抑制胰島β細(xì)胞分泌胰島素，減輕高胰島素血癥。Lep對(duì)胰島素分泌調(diào)解作用發(fā)生障礙，會(huì)導(dǎo)致脂肪代謝的紊亂。本項(xiàng)研究顯示，酒精性肝炎、酒精性肝硬化患者血清Lep水平和HOMA-IR均高于健康者，提示血清Lep可能與酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。同時(shí)，3組血清Lep水平與HOMAIR呈正相關(guān)。因此，我們推斷Lep參與酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制可能為:血清中高水平Lep可以促進(jìn)IR的發(fā)生，導(dǎo)致胰島素信號(hào)傳導(dǎo)異常，進(jìn)而使得游離脂肪酸在肝細(xì)胞堆積，引起酒精性肝病的發(fā)生［9］。

LEPR基因?qū)偌?xì)胞因子受體超家族，由1 165個(gè)氨基酸組成，來(lái)自于單堿基變異導(dǎo)致的基因序列多態(tài)性，人類(lèi) LEPR基因第六外顯子上存在有Gln223Arg變異［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，AC組與對(duì)照組基因頻率存在顯著性差異(P＜0．05)。這提示LEPR基因序列多態(tài)性可能與酒精性肝硬化的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。LEPR基因Gln223Arg變異，可能通過(guò)影響Lep與LEPR的結(jié)合活性，使Lep-LEPR的功能異常，引起Lep抵抗，導(dǎo)致胰島素—瘦素軸的調(diào)節(jié)失衡。血清中高水平Lep可以增強(qiáng)Ⅰ型前膠原的表達(dá)，發(fā)揮促肝纖維化的作用;同時(shí)Lep還可以促進(jìn)TGF-β1的表達(dá)，誘導(dǎo) HSC 活化，促進(jìn)肝纖維化形成［11～13］。

綜上所述，Lep及LEPR基因Gln223Arg多態(tài)性可能通過(guò)胰島素—瘦素軸，促進(jìn)IR，影響體內(nèi)脂肪代謝，參與酒精性肝病的發(fā)病機(jī)制。

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