雌激素對子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響及其機制探討

翟永寧，仲 丹，張 蕾，吳王飛，盧 瑩，周 靜，沈宇飛

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬南京婦幼保健院，南京210004)

正常情況下子宮內(nèi)膜組織僅存在于子宮內(nèi)，若其植入機體其他部位并生長即稱為子宮內(nèi)膜異位癥［1］。Kitawaki等［2］研究證實，子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展與雌激素密切相關(guān)，是一種雌激素依賴性疾病。顧玲芬等［3］研究證實，異位內(nèi)膜生物學(xué)特性不同于在位內(nèi)膜，可能與其發(fā)病機理及局部激素環(huán)境有關(guān)。而子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生的家族聚集性，也提示該病的發(fā)生有遺傳性［4］。有研究通過構(gòu)建在位內(nèi)膜和異位內(nèi)膜差異基因cDNA文庫篩選差異表達(dá)基因，發(fā)現(xiàn)前列腺特異性酸性磷酸酶(PSAP)基因在子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜中呈高表達(dá)［5］。2009年1月～2012年12月，我們觀察了雌激素對子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡的影響，并探討其機制。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1．1 材料 正常子宮內(nèi)膜標(biāo)本均取自南京婦幼保健院就診、因子宮肌瘤切除子宮的患者，并排除其他全身性及內(nèi)分泌性疾病。雌激素(E2257)購自美國Sigma公司，RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購自美國 Gibco公司，Trizol試劑、空載體 pGPU6/GFP/Neo購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄(RT)試劑盒、定量PCR檢測試劑盒購自日本TOYOBO公司，內(nèi)切酶BamHⅠ和 BbsⅠ購自寶生物工程(大連)有限公司。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 將子宮內(nèi)膜標(biāo)本置于含有10%FBS和DMEM的培養(yǎng)液中，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng);細(xì)胞經(jīng)胰酶消化后以每孔2×106接種于6孔板，每組3個復(fù)孔。將標(biāo)本隨機分為C組及 E8、E7、E6 組，C 組不加雌激素，E8、E7、E6 組細(xì)胞貼壁后分別加入濃度為 10－8、10－7、10－6mmol/L的雌激素。

1．2．2 子宮內(nèi)膜細(xì)胞周期和凋亡檢測 采用流式細(xì)胞術(shù)。用胰酶消化每組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min后棄上清;用預(yù)冷的PBS洗1遍，離心后留少量PBS;彈勻后加入細(xì)胞固定液，4℃固定10 h;離心5 min，吸出上清，殘留少量固定液，加入預(yù)冷的PBS洗1遍;配制新鮮碘化丙啶染色液，每管細(xì)胞加入500μL;緩慢并充分重懸細(xì)胞，37℃避光溫浴30 min后上流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長488 nm下檢測紅色熒光，同時檢測光散射情況。每組細(xì)胞同時各用兩種gate(gate1和gate2)進(jìn)行檢測，以進(jìn)行各組間凋亡情況的比較。

1．2．3 PSAP基因表達(dá)量檢測 子宮內(nèi)膜細(xì)胞在雌激素作用下培養(yǎng)3 d，采用Real-time PCR法檢測每組樣本中PSAP基因表達(dá)量。用Trizol試劑進(jìn)行RNA提取，提取后的RNA采用微量分光光度計法進(jìn)行樣本濃度測定，采用 TaKaRa kit Cat(NO．DRR037A)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PSAP基因上游引物5'-GCAAGCCCCAGCCAAAGGATAATG-3'，下游引物5'-AGGGCCCAGGCGGTCACACTC-3'，PCR 引物擴增長度146 bp。染料法熒光定量PCR反應(yīng)條件:94℃、3 min，94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共 35個循環(huán)。72℃檢測熒光信號。每組同時檢測PSAP基因和內(nèi)參18 S基因，每組PSAP基因表達(dá)量=PSAP基因的拷貝數(shù)/參考基因的拷貝數(shù)。

1．2．4 基因干擾后子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡及PSAP基因表達(dá)量檢測 PSAP基因干擾載體的構(gòu)建:PSAP基因shRNA模板中的loop結(jié)構(gòu)選用了TTCAAGAGA以避免形成終止信號，shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu);正義鏈模板的5'端添加了CACC，與BbsⅠ酶切后形成的黏端互補，反義鏈模板的5'端添加了GATC，與BamHⅠ酶切后形成的黏端互補，如果shRNA的第一個堿基不是G，則在CACC后補加1個G;將pGPU6/GFP/Neo載體用BamHⅠ和BbsⅠ進(jìn)行酶切使之線性化，將酶切后的載體與shRNA進(jìn)行連接，形成pGPU6/GFP/Neo-shRNA，并進(jìn)行酶切鑒定，陽性重組載體再進(jìn)行測序鑒定。將pGPU6/GFP/Neo-shRNA轉(zhuǎn)染至培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜細(xì)胞中，培養(yǎng) 3 d，按照 1．2．2、1．2．3 的方法檢測干擾前后子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡和PSAP基因表達(dá)量。

1．2．5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用STATA11．0統(tǒng)計軟件。計量資料以ˉx±s表示，組間比較采用t檢驗。P≤0．05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 各組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡及PSAP基因表達(dá)量比較 見表1。

2．2 基因干擾后子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡及PSAP基因表達(dá)量比較 干擾前后進(jìn)入G0/G1期的子宮內(nèi)膜細(xì)胞比分別為26．4% ±1．7%、40．4% ±3．7%，進(jìn)入S期的子宮內(nèi)膜細(xì)胞比分別為68．4% ±4．3%、48．0% ±3．2%，P 均 ＜0．05。干擾前后子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率分別為 18．2% ±1．3%、10．2% ±0．7%，PSAP 基因表達(dá)量分別為50．4 ±3．2、19．2 ±1．3，P 均＜0．05。

表1 各組子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡率、周期及 PSAP表達(dá)量比較(ˉx±s)

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是指子宮內(nèi)膜的腺體和間質(zhì)生長在子宮腔以外的病癥，發(fā)病年齡為25～45歲，發(fā)病率為10% ～15%，近年來呈明顯增高趨勢，給廣大女性患者造成極大痛苦［6，7］。其發(fā)病機制尚未完全明確，當(dāng)前的研究重點集中在子宮內(nèi)膜異位癥形成的相關(guān)基因［8］。既往的研究并未發(fā)現(xiàn)某一明確的基因與該病的發(fā)生有根本性的作用;近期基因芯片的研究提示，PSAP基因在子宮內(nèi)膜異位組織中高表達(dá)，提示該基因在子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生、發(fā)展中存在著一定的作用。近來研究發(fā)現(xiàn)，PSAP基因在人乳腺癌及卵巢癌細(xì)胞中與procathepsin D相互作用［9］，在腫瘤的侵蝕及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，而且表達(dá)受到雌激素的影響。有研究發(fā)現(xiàn)，PSAP基因在成年及胚胎的生殖系統(tǒng)中是高表達(dá)的［10，11］。在PSAP基因敲除的突變小鼠中，性腺的體積和質(zhì)量都減少，表明其在生殖系統(tǒng)中起著重要的作用，可能涉及到生殖器官的生長、維持及其細(xì)胞的分化;同時該研究也證實，PSAP基因在子宮內(nèi)膜中特異表達(dá)，在子宮內(nèi)膜異位病灶中高表達(dá)，進(jìn)一步證實了PSAP基因在子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生中具有一定的作用［12］。

本研究發(fā)現(xiàn)，雌激素濃度的增加，E8和E7組的細(xì)胞凋亡率(gate1)無明顯差別，但在增加雌激素濃度后，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡率又再次增加;而PSAP基因的表達(dá)隨雌激素濃度的增加，呈一種“V”形改變，先是逐漸降低，后又增加，似乎雌激素濃度的增加，觸發(fā)了PSAP基因表達(dá)的閾值。在正常人，雌激素的分泌有其自然周期，絕經(jīng)后雌激素的分泌減少，子宮內(nèi)膜異位癥也可以自愈了。在基因干擾后，進(jìn)入G期的細(xì)胞增多，進(jìn)入S期的細(xì)胞減少，因此細(xì)胞凋亡明顯減少。雌激素濃度的改變造成細(xì)胞凋亡的變化，可能與雌激素受體的過表達(dá)也有關(guān)系。有研究證實，雌激素受體過表達(dá)可以同時以配體非依賴性和配體依賴性的方式抑制細(xì)胞增殖和增加細(xì)胞凋亡［13］。因此，在子宮內(nèi)膜異位癥中，PSAP基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡增加，可能與子宮內(nèi)膜異位病灶的形成、增大有一定的關(guān)系。

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