116例多發(fā)性骨髓瘤免疫特征表型分析

劉 莉

（武漢大學(xué)中南醫(yī)院血液內(nèi)科 430071）

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種起源于B細(xì)胞的惡性克隆性漿細(xì)胞疾病，以骨髓中積聚大量惡性漿細(xì)胞并分泌單克隆免疫球蛋白和溶骨性病變?yōu)樘卣鳎谂R床中許多患者不完全具備這些典型特征。隨著對(duì)MM認(rèn)識(shí)的深入，骨髓瘤細(xì)胞的免疫表型特征及其對(duì)疾病的診斷、治療和預(yù)后等方面的影響越來(lái)越引起人們的重視。本實(shí)驗(yàn)采用三色流式細(xì)胞術(shù)分析MM患者骨髓中骨髓瘤細(xì)胞的免疫表型特征，并分析其中CD45和CD19與臨床生物學(xué)特征的關(guān)系，為臨床明確診斷以及預(yù)后提供重要依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集武漢大學(xué)中南醫(yī)院近4年收治的MM患者116例，MM的診斷符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》的診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者均進(jìn)行了X線片、β2微球蛋白（β2－MG）、C反應(yīng)蛋白（CRP）、血肌酐、血常規(guī)檢查。

1.2 試劑與儀器 所用單克隆抗體、溶血素、破膜劑均購(gòu)自美國(guó)BD公司，包括 CD38、CD19、CD56、CD138、CD20、CD34、CD7、CD33、CD117、kappa、lambda，流式細(xì)胞儀為 Beckman FC500。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

1.3.1 膜抗原檢測(cè) 取新鮮肝素抗凝骨髓液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至（4～10）×109/L，取100μL骨髓液加入單克隆抗體20μL，室溫避光孵育15min，加入溶血素溶解紅細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2遍后上機(jī)，分析50 000個(gè)骨髓瘤細(xì)胞表面抗原的表達(dá)情況。

1.3.2 胞漿抗原檢測(cè) 將調(diào)整濃度后的100μL骨髓液加入單克隆膜抗體20μL，室溫避光孵育15min，加入溶血素溶解紅細(xì)胞，PBS洗滌后加入kappa、clambda抗體避光孵育15 min，PBS洗滌2遍后上機(jī)。CD45/SSC設(shè)門(mén)，以mouse IgG1－FITC/IgG1－PE/IgG1－PerCP作為同型對(duì)照，軟件分析骨髓瘤細(xì)胞各種抗原的表達(dá)率。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果判斷以細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)抗原表達(dá)大于20%為陽(yáng)性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS18.0軟件，數(shù)據(jù)分析采用四格表檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MM患者性別及年齡分布 116例MM患者中，男52例，女64例；男性患者平均58.7歲，女性患者平均60.1歲，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。MM的平均診斷年齡為59.4歲，其中20例（17.2%）發(fā)病在70歲以上，27例（23.3%）發(fā)病在60～70歲，69例（59.5%）發(fā)病在60歲以下，60歲以下包括了20例50歲以下患者。

2.2 MM的免疫表型分析 116例MM中，CD38陽(yáng)性率為100.0%，CD138陽(yáng)性率也較高，達(dá)96.6%，其次陽(yáng)性率由高到低分別為 CD33（70.0%）、CD56（60.7%），CD117（25.6%），CD19和CD20的陽(yáng)性率較低，均低于20.0%，CD7和CD34均為陰性表達(dá)，κ輕鏈型占34.5%，λ輕鏈型占48.3%。與典型的MM免疫表型不同，有17.2%的病例CD45陽(yáng)性，但熒光強(qiáng)度較正常漿細(xì)胞有所減弱。12例患者CD19陽(yáng)性或弱陽(yáng)性，需要同正常漿細(xì)胞鑒別。CD45與臨床分期有關(guān)，陽(yáng)性時(shí)分期較好。CD45與貧血、腎損害無(wú)關(guān)；與CD45陰性組相比，CD45陽(yáng)性組骨破壞發(fā)生率較低，β2－MG、CRP水平較低。CD19與臨床分期有關(guān)，陽(yáng)性時(shí)分期較差。CD19陽(yáng)性組更易發(fā)生貧血，微球蛋白、C反應(yīng)蛋白水平較高，骨破壞、腎損害的發(fā)生率與CD19陰性組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 CD45、CD19與臨床相關(guān)表現(xiàn)的關(guān)系

3 討 論

本研究結(jié)果顯示，116例MM患者中，男性占44.2%，女性占55.8%，女性略高于男性，男女發(fā)病年齡未見(jiàn)明顯差異，其中20例發(fā)病于50歲以下，平均診斷年齡為59.4歲，高于文獻(xiàn)報(bào)道的平均發(fā)病年齡65歲，提示MM發(fā)病有逐漸年輕化的趨勢(shì)。

多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)能對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行多個(gè)抗原檢測(cè)，可同時(shí)對(duì)細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)抗原進(jìn)行分析，并且其表達(dá)水平可以定量，因此流式細(xì)胞術(shù)能很好地識(shí)別并呈現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞的各種特征。通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原表達(dá)的強(qiáng)弱、異?？乖某霈F(xiàn)及細(xì)胞內(nèi)免疫球蛋白的輕鏈限制性有無(wú)，可以把骨髓瘤細(xì)胞和正常漿細(xì)胞區(qū)別開(kāi)來(lái)。正常漿細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)CD38和CD27，表達(dá)CD138，無(wú)輕鏈限制性，CD45和CD19與正常成熟B細(xì)胞相比表達(dá)較弱，不表達(dá)CD56、CD117、CD28，不表達(dá)B系抗原CD20、CD22。典型的MM細(xì)胞免疫分型特點(diǎn)為：異常表達(dá)CD28、CD117、CD20、CD56、CD13、CD33；CD27和 CD38表達(dá)減弱，CD19和CD45不表達(dá)，有輕鏈限制性。本研究與上述結(jié)論一致，但其中有10.4%的患者表達(dá)CD19，17.2%的患者表達(dá)CD45，與秦燕等［1］的結(jié)果較為一致，國(guó)外有報(bào)道骨髓瘤細(xì)胞CD45陽(yáng)性率達(dá)到了31.0%［2］，可能與人種差異有關(guān)。這些結(jié)果顯示少部分MM患者的免疫表型不典型，需結(jié)合CD38、CD56、kappa、lambda等抗原的表達(dá)情況與正常漿細(xì)胞鑒別。這些免疫表型異質(zhì)性的發(fā)現(xiàn)提示，骨髓瘤細(xì)胞的克隆可能經(jīng)歷一定程度的分化與成熟，上述標(biāo)志物在早期或漿母細(xì)胞中可能會(huì)出現(xiàn)陽(yáng)性［3］。

CD45和CD19對(duì)于MM患者是否有預(yù)后意義，近年來(lái)國(guó)外學(xué)者有過(guò)一些探索。Moreau等［2］對(duì)95例MM患者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，漿細(xì)胞上缺失了CD45的患者生存期更短。Asosingh等發(fā)現(xiàn)CD45陰性瘤細(xì)胞的小鼠骨髓中都出現(xiàn)了彌漫性瘤細(xì)胞浸潤(rùn)，其血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子mRNA水平是CD45陽(yáng)性瘤細(xì)胞的4倍多，提示病情進(jìn)展。MM患者中，CD45或CD19陽(yáng)性的比例較低，且因?yàn)闃颖緮?shù)少的限制，目前國(guó)內(nèi)還沒(méi)有它們與臨床分期及臨床生物學(xué)指標(biāo)關(guān)系的報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤中漿細(xì)胞上的CD45表達(dá)與臨床分期有關(guān)，CD45陽(yáng)性組分期較好，與CD45陰性組相比，骨破壞發(fā)生率更低，β2－MG、CRP水平較低，貧血、腎損害的發(fā)生率則無(wú)明顯差異。CD45陽(yáng)性組14q32染色體易位發(fā)生率較低，如t（4；14），t（14；16）等［2］，該染色體異常是多 MM 復(fù)發(fā)和預(yù)后的重要因素［5］。Akt/PI3K通路參與了骨髓瘤細(xì)胞的增殖，當(dāng)CD45陽(yáng)性時(shí)，Akt不能活化，影響了骨髓瘤細(xì)胞的增殖，這些可能是CD45陽(yáng)性者預(yù)后較好的內(nèi)在機(jī)制［6］。

CD19是相對(duì)分子質(zhì)量為95×103的糖蛋白，與B細(xì)胞的活化調(diào)節(jié)和發(fā)育調(diào)節(jié)相關(guān)，是在B細(xì)胞分化早期階段后天獲得的一個(gè)標(biāo)記物，在B細(xì)胞成熟期間出現(xiàn)，在正常骨髓漿細(xì)胞大多數(shù)中仍然表達(dá)。CD19陽(yáng)性患者數(shù)量較少，但是與CD19陰性患者相比，CD19陽(yáng)性患者預(yù)后較差，無(wú)進(jìn)展生存期和整體存活期，大約分別短1年和2年。Rawstron等［7］分析了587例經(jīng)統(tǒng)一方案化療后接受移植的MM患者，結(jié)果顯示缺乏CD56表達(dá)，過(guò)表達(dá)CD19、CD28提示預(yù)后不良。本研究結(jié)果顯示，CD19與臨床分期有關(guān)，陽(yáng)性時(shí)分期較差。CD19陽(yáng)性時(shí)，β2－MG、CRP水平較高，更易發(fā)生貧血，與骨破壞、腎損害無(wú)關(guān)。β2－MG、CRP、分期等臨床指標(biāo)都是MM的預(yù)后因素，因此，CD45和CD19的表達(dá)情況與預(yù)后有一定的相關(guān)性，其發(fā)生機(jī)制還需要進(jìn)一步的探索。

免疫表型檢測(cè)是鑒別MM和其他漿細(xì)胞良性增生的重要手段，可以彌補(bǔ)形態(tài)學(xué)的不足。本研究通過(guò)對(duì)116例MM患者的免疫表型特征進(jìn)行分析，了解MM的表型特點(diǎn)并分析了CD45、CD19和臨床分期及臨床生物學(xué)指標(biāo)的關(guān)系，為此類(lèi)疾病的診斷、治療、預(yù)后評(píng)價(jià)等提供新的依據(jù)，并研究CD45和CD19的表達(dá)與骨破壞、腎損害、β2－MG、CRP、貧血等之間可能存在的關(guān)系和臨床治療方案，減少患者痛苦及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)提供了一條新的線索。

［1］ 秦燕，丁潤(rùn)生，陸偉，等.多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)在多發(fā)性骨髓瘤診斷中的價(jià)值［J］.交通醫(yī)學(xué)，2009，23（2）：137－138.

［2］ Moreau P，Robillard N，Avet－Loiseau H，et al.Patients with CD45negative multiple myeloma receiving high－dose therapy have a shorter survival than those with CD45 positive multiple myeloma［J］.Haematologica，2004，89（5）：547－551.

［3］ Pérez－Andrés M，Almeida J，Martín－Ayuso M，et al.Clonal plasma cells from monoclonal gammopathy of undetermined significance，multiple myeloma and plasma cell leukemia show different expression profiles of molecules involved in the interaction with the immunological bone marrow microenvironment［J］.Leukemia，2005，19（3）：449－455.

［4］ Asosingh K，De Raeve H，Menu E，et al.Angiogenic Switchduring 5T2MM murine myeloma tumorigenesis：role ofCD45heterogenecity［J］.Blood，2004，103（8）：3131－3137.

［5］ Trcic RL.Cytogenetics of multiple myeloma［J］.Coll Antropol，2010，34（1）：41－44.

［6］ Descamps G，Pellat－Deceunynck C，Szpak Y，et al.The magnitude of Akt/phosphatidylinositol 3′－kinase proliferating signaling is related to CD45expression in human myeloma cells［J］.J Immunol，2004，173（8）：4953－4959.

［7］ Rawstron AC，Orfao A，Beksac M，et al.Report of the European myeloma network on multiparametric flow cytometry in multiple myeloma and related disorders［J］.Haematologica，2008，93（3）：431－438.