慢性乙型肝炎病毒感染者外周血T細(xì)胞亞群分析及與病毒載量相關(guān)性研究

朱蘇蘭，魯 陳，熊德琴，李左娟（.江西省贛州市信豐縣贛南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 4600；.江西省南昌市第九醫(yī)院 000；.江西省兒童醫(yī)院，南昌 000）

乙型病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制并不是由乙型肝炎（下稱乙肝）病毒（HBV）直接引起肝細(xì)胞損害，目前認(rèn)為細(xì)胞免疫在清除病毒、引起肝損害中起了重要作用［1］。T淋巴細(xì)胞是主導(dǎo)機(jī)體免疫功能最主要的免疫細(xì)胞之一，它可直接針對(duì)已感染HBV的肝細(xì)胞膜上所表達(dá)的病毒抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)，并對(duì)病毒的清除產(chǎn)生作用。本試驗(yàn)旨在探討乙肝患者周圍血T淋巴細(xì)胞亞群以及其與乙型肝炎病毒復(fù)制的關(guān)系，現(xiàn)將檢測(cè)結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2010年12月至2012年3月南昌市第九醫(yī)院住院及門診患者診斷為慢性乙肝病例92例，臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2010年全國病毒件肝炎會(huì)議修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》［2］。無合并甲、丙、丁、戊型肝炎病毒感染的實(shí)驗(yàn)室證據(jù)；排除酒精性肝炎、自身免疫性肝炎等其他肝炎；排除腫瘤、自身免疫性疾病、其他感染性疾病。健康對(duì)照組20例來源于同一時(shí)期健康體檢人群。

1.2 方法

1.2.1 患者分組 所有患者分為3組：（1）HBV攜帶組30例，男12例，女18例；慢性乙肝患者35例，其中男24例，女11例；慢性重型乙肝患者組27例，其中男18例，女9例。健康對(duì)照組20例，其中男5例，女15例。入選患者根據(jù)患者外周血病毒量分為以下3組：（1）DNA陰性組（16例），HBV DNA為陰性的患者。（2）低病毒載量組（31例），HBV DNA為1×103～1×105的患者。（3）高病毒載量組（45例），HBV DNA為1×106～1×108的患者。

1.2.2 外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定外周血T淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志。儀器購自美國BD公司，型號(hào)為FACSCalibur。試劑由BD公司生產(chǎn)。

1.2.3 血清HBV病毒載量測(cè)定 采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)進(jìn)行檢測(cè)法。儀器為美國ABI7300型基因擴(kuò)增儀，試劑由杭州艾康生物有限公司提供，嚴(yán)格按說明書操作，結(jié)果大于1.0×103copy/mL為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 健康對(duì)照組與HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果 見表1。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，健康對(duì)照組與HBV攜帶者組比較，T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；健康對(duì)照組、HBV攜帶者組與慢性乙肝患者組相比只有CD4＋差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；健康對(duì)照組、HBV攜帶者組與慢性重型乙肝組比較，T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；慢性乙肝患者組與慢性重型乙肝比較只有CD4＋差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 健康對(duì)照組與HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果（±s）

表1 健康對(duì)照組與HBV感染者外周血T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果（±s）

注：與健康對(duì)照組比較，aP＜0.05；與 HBV攜帶組比較，b P＜0.05；與慢性乙肝患者組比較，c P＜0.05。

組別 n CD4＋（%） CD8＋（%） CD4＋/CD8＋20 47.2±5.8 34.3±5.3 1.40±0.46 HBV攜帶組 30 46.3±5.6 34.0±5.9 1.35±0.37慢性乙肝患者組 35 43.3±6.2ab 37.2±6.8 1.17±0.48慢性重型乙肝組 27 38.8±6.8abc 40.8±7.8ab 0.95±0.42健康對(duì)照組a

2.2 健康對(duì)照組和各組不同病毒載量的HBV感染者T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定結(jié)果 見表2。結(jié)果顯示，健康對(duì)照組與DNA陰性組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；健康對(duì)照組與低病毒載量組、高病毒載量組相比，T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DNA陰性組與低病毒量組比較除CD4＋外CD8＋、CD4＋/CD8＋差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；DNA陰性組與高病毒載量組比較，T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低病毒載量組與高病毒載量組比較，T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 健康對(duì)照組和各組不同病毒載量的HBV感染者T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果（±s）

表2 健康對(duì)照組和各組不同病毒載量的HBV感染者T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果（±s）

注：與健康對(duì)照組比較，aP＜0.05；與DNA陰性組比較，b P＜0.05；與低病毒載量組比較，c P＜0.05。

組別 n CD4＋（%） CD8＋（%） CD4＋/CD8＋20 47.2±5.8 34.3±5.3 1.40±0.46 DNA陰性組 16 46.8±5.1 34.1±5.2 1.38±0.35低病毒載量組 31 43.8±5.6a 38.0±6.7ab 1.13±0.41ab高病毒載量組 45 38.5±7.31abc 41.4±7.1abc 0.91±0.40健康對(duì)照組abc

3 討 論

HBV是一種嗜肝DNA病毒，感染HBV后病毒在體內(nèi)長期存在、不斷復(fù)制，病毒不能被清除，這些患者稱HBV慢性感染者。慢性病毒感染者中，如果肝功能一直正常，稱為慢性病毒攜帶者；反之，如果引起肝功能異常則稱為慢性肝炎。慢性肝炎患者病毒復(fù)制水平、肝損害程度、免疫反應(yīng)形式等個(gè)體差異很大。

T細(xì)胞由不同的亞群組成，CD4＋、CD8＋細(xì)胞代表兩類主要T細(xì)胞，CD4＋T淋巴細(xì)胞主要是輔助型T淋巴細(xì)胞（Th），Th在病毒的免疫應(yīng)答中發(fā)揮中心作用，同時(shí)，對(duì)病毒清除起重要作用［3］。CD8＋T細(xì)胞激活和抑制嚴(yán)格依賴CD4＋T細(xì)胞。CD8＋T細(xì)胞主要包括細(xì)胞毒性T細(xì)胞（Tc）和抑制性T細(xì)胞（Ts），Ts通過釋放分泌可溶性介質(zhì)下調(diào)體液免疫和細(xì)胞免疫。Tc是細(xì)胞免疫的主要效應(yīng)細(xì)胞，在被細(xì)胞因子激活后，產(chǎn)生穿孔素和顆粒酶，將靶細(xì)胞破壞，這是HBV感染后引起肝細(xì)胞損傷的主要原因，也是機(jī)體清除細(xì)胞內(nèi)病毒的主要機(jī)制［4］。在正常情況下，二者保持一定比例，處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，維持機(jī)體細(xì)胞免疫功能。為了解慢性HBV感染者細(xì)胞免疫功能情況，本試驗(yàn)檢測(cè)了92例慢性HBV感染者T淋巴細(xì)胞亞群，結(jié)果顯示HBV攜帶組與健康對(duì)照組比較T淋巴細(xì)胞亞群結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明HBV攜帶者多處于免疫耐受期，機(jī)體不能產(chǎn)生針對(duì)HBV的細(xì)胞免疫應(yīng)答，肝組織無明顯免疫損傷，故T細(xì)胞亞群 CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋水平無明顯變化。慢性乙肝組患者CD4＋與健康對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，慢性重型乙肝組患者CD4＋、CD8＋和CD4＋/CD8＋與健康對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以慢性重型乙肝外周血CD4＋、CD8＋和CD4＋/CD8＋最為明顯，提示細(xì)胞免疫在乙肝發(fā)展為重型肝炎進(jìn)程中是不可忽視的重要因素。不同臨床類型慢性HBV感染者之間也有不同程度的差異，呈一定次序的規(guī)律性：從健康對(duì)照組到慢性重型乙肝組CD4＋、CD4＋/CD8＋逐漸降低，而CD8＋則逐漸升高。CD4＋T細(xì)胞降低，表明機(jī)體免疫功能下降，感染HBV后不易清除，是導(dǎo)致HBV感染慢性化的重要原因之一，與目前研究結(jié)果一致［5］；增加的CD8＋T細(xì)胞一般認(rèn)為主要是Tc，慢性乙肝患者肝活檢發(fā)現(xiàn)，肝小葉壞死區(qū)周圍存在大量的Tc，造成肝細(xì)胞不斷破壞引起患者血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶持續(xù)升高。

外周血HBV載量是反映病毒感染和復(fù)制程度的重要指標(biāo)。流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果表明，持續(xù)高HBV載量發(fā)生肝硬化和肝細(xì)胞癌的患者明顯增加，這說明高HBV病毒載量患者免疫功能低下［6］。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，DNA 陰性組 CD4＋、CD4＋/CD8 下降，CD8 升高，但與健康對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明病毒無活動(dòng)性復(fù)制，存在HBV整合的肝細(xì)胞，免受特異性細(xì)胞毒細(xì)胞的攻擊而免于被破壞。高病毒載量組和低病毒載量組CD4＋、CD8＋、CD4＋/CD8＋與健康對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且高病毒載量患者比低病毒載量患者T淋巴細(xì)胞亞群變化更明顯，這與董莉等［7］報(bào)道吻合。在 HBV DNA復(fù)制時(shí)患者體內(nèi)存在免疫抑制因子，能抑制T細(xì)胞增殖和CD4＋T細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素－2（IL－2），而IL－2可引起 T細(xì)胞亞群相互影響，造成細(xì)胞免疫功能失調(diào)，病毒難以清除［8］。

綜上所述，慢性HBV感染者T細(xì)胞亞群改變不僅與HBV感染有關(guān)，也與HBV DNA復(fù)制有關(guān)，HBV DNA復(fù)制可進(jìn)一步導(dǎo)致乙肝患者細(xì)胞免疫功能紊亂。即肝細(xì)胞損害與HBV病毒載量和T淋巴細(xì)胞亞群密切相關(guān)。因此，通過對(duì)慢性HBV感染者T細(xì)胞亞群和病毒載量檢測(cè)可了解機(jī)體的免疫功能，從而為臨床抗病毒治療療效及預(yù)后的判斷提供了科學(xué)依據(jù)，并有可能通過改善免疫細(xì)胞紊亂來治療慢性HBV感染。

［1］ 龍昭華，朱薏，蘇杭，等.乙型肝炎病毒攜帶孕婦外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平分析［J］.國際醫(yī)藥衛(wèi)生導(dǎo)報(bào)，2009，15（13）：4－5.

［2］ 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)，中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病學(xué)分會(huì).2010版慢性乙型肝炎防治指南［J］.中華肝臟病雜志，2011，16 11－16.

［3］ 顧錫炳，楊小娟，王棟，等.慢性乙型肝炎患者血清HBV DNA水平與外周血T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞計(jì)數(shù)的關(guān)系［J］.實(shí)用肝臟病雜志，2010，13（6）：441－442.

［4］ 李鴻賓，江曉萍，葉珺，等.測(cè)定慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群的臨床意義［J］.安徽醫(yī)藥，2006，10（8）：588－589.

［5］ 何英，張?jiān)势?，吳潤香，?慢性乙型肝炎患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群變化與病毒復(fù)制的關(guān)系［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2009，24（11）：808－811.

［6］ You J，Zhuang L，Zhang YF，et al.Peripheral T－lymphocyte subpopulations in different clinical stages of chronic HBV infection correlate with HBV load［J］.World J Gastroenterol，2009，15：3382－3393.

［7］ 董莉，李軍，韓亞萍，等.阿德福韋酯對(duì)HBeAg陽性慢性乙型肝炎患者外周血T細(xì)胞亞群的影響［J］.蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2008，28（6）：962－965.

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