三維試驗(yàn)檢測(cè)耐頭孢他啶銅綠假單胞菌產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶

陳 紅（湖南省益陽(yáng)市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科 413000）

銅綠假單胞菌為專性需氧非發(fā)酵革蘭陰性桿菌，廣泛存在于自然環(huán)境中，是醫(yī)院及社區(qū)感染中常見(jiàn)病原菌，可引起包括皮膚軟組織感染、肺炎、敗血癥等在內(nèi)的多種疾?。?］。近年來(lái)，隨著廣譜抗菌藥物廣泛使用，銅綠假單胞菌多重耐藥現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。有研究表明，銅綠假單胞菌產(chǎn)生各種產(chǎn)超廣譜β－內(nèi)酰胺酶（ESBLs），是其對(duì)β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機(jī)制［2］。為了解本院銅綠假單胞菌產(chǎn)β－內(nèi)酰胺酶現(xiàn)狀，本研究對(duì)2009年6至2012年5月本院臨床標(biāo)本中出現(xiàn)的耐頭孢他啶銅綠假單胞菌采用改良三維試驗(yàn)檢測(cè)其β－內(nèi)酰胺酶，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 收集2009年6月至2012年5月本院臨床標(biāo)本中分離的耐頭孢他啶銅綠假單胞菌非重復(fù)菌株65株。

1.2 試劑 M－H培養(yǎng)基干粉購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，克拉維酸（CLA）、氯唑西林（CLO）購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，其余所有藥敏紙片均購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株鑒定及藥敏試驗(yàn) 各臨床科室送檢標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)后取可疑菌落按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》（第3版）進(jìn)行操作鑒定。藥敏試驗(yàn)采用K－B法，結(jié)果判定參照2012年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。以大腸埃希菌（ATCC 25922）、銅綠假單胞菌（ATCC 27853）為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株。

1.3.2 改良三維試驗(yàn)檢測(cè)ESBLs、AmpC和金屬酶 三維試驗(yàn)參照文獻(xiàn)［3］并進(jìn)行改良。酶粗提物制備：取純培養(yǎng)菌落2～3個(gè)，涂在1/4M－H平皿上37℃孵育過(guò)夜；刮下菌苔于1mL生理鹽水中，4℃，4 000r/min離心20min后棄上清液，加入700μL生理鹽水于EP管中，－20℃保存，反復(fù)凍融6次，4℃，12 000r/min離心20min，上清液經(jīng)常規(guī)細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果為陰性后，置－20℃保存?zhèn)溆?。三維試驗(yàn)：取2個(gè)M－H平皿，分別均勻涂布0.5麥?zhǔn)蠁挝淮竽c埃希菌（ATCC 25922），平皿中央分別貼30μg頭孢噻肟和亞胺培南，距離紙片邊緣5mm處打孔，貼頭孢噻肟的平皿分別加45μL酶粗提液加5μL生理鹽水、45μL酶粗提液加5μL 2mmol克拉維酸、45μL酶粗提液加5μL 2mmol氯唑西林、45μL酶粗提液加5μL 2mmol克拉維酸加5μL 2mmol氯唑西林；貼亞胺培南的平皿分別加45μL酶粗提液加5μL生理鹽水、45μL酶粗提液加5μL 0.5 mol乙二胺四乙酸（EDTA）于孔中，避免酶粗提液溢出孔外，35℃溫箱孵育過(guò)夜。孔與抑菌圈交界處出現(xiàn)擴(kuò)大的長(zhǎng)菌區(qū)域，表明該酶能水解頭孢噻肟或亞胺培南，同時(shí)觀察能否被CLA、CLO和EDTA所抑制。以陰溝腸桿菌為陽(yáng)性對(duì)照，以大腸埃希菌（ATCC 25922）為陰性對(duì)照。

2 結(jié) 果

2.1 藥敏試驗(yàn) 65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 見(jiàn)表1。

表1 65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌藥敏試驗(yàn)（%）

2.2 改良三維試驗(yàn)測(cè)定65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌 見(jiàn)表2。65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌中，單產(chǎn)ESBLs 30株，單產(chǎn)AmpC酶4株，同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶10株，同時(shí)產(chǎn)ESBLs和金屬酶15株，同時(shí)產(chǎn)AmpC酶和金屬酶2株，產(chǎn)其他β－內(nèi)酰胺酶4株。

表2 65株耐頭孢他啶銅綠假單胞菌藥物敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

頭孢他啶是治療銅綠假單胞菌感染的一線藥物。近年來(lái)，隨著β－內(nèi)酰胺類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，銅綠假單胞菌對(duì)頭孢他啶的耐藥性明顯上升，且常因?qū)Χ喾N抗菌藥物耐藥而導(dǎo)致治療失敗，已成為臨床抗感染治療的棘手難題。由表1可見(jiàn)，耐頭孢他啶的銅綠假單胞菌通常伴有其他多類抗菌藥物耐藥。目前引起臨床關(guān)注的β－內(nèi)酰胺酶有：ESBLs、AmpC、對(duì)酶抑制劑敏感性下降的β－內(nèi)酰胺酶（IRTs）、金屬酶和非金屬酶的碳青霉烯酶。銅綠假單胞菌對(duì)β－內(nèi)酰胺類藥物耐藥主要產(chǎn)生各種β－內(nèi)酰酶，它們可定位于質(zhì)?；蛉旧w上，對(duì)β－內(nèi)酰酶高度耐藥和酶抑制劑耐藥。在院內(nèi)感染的監(jiān)測(cè)中，為了便于及時(shí)切斷耐藥基因的傳播，監(jiān)測(cè)細(xì)菌的產(chǎn)酶機(jī)制有十分重要的意義［4］。

改良三維試驗(yàn)利用ESBLs能被CLA抑制，不被CLO抑制；AmpC酶則不能被CLA抑制，但可被CLO抑制；金屬酶可被EDTA抑制等特性來(lái)檢測(cè)ESBLs、AmpC酶和金屬酶。采用細(xì)菌酶液進(jìn)行操作，避開細(xì)菌外膜滲透機(jī)制和抗菌藥物泵出機(jī)制對(duì)試驗(yàn)的干擾，因而不受抗菌藥物的誘導(dǎo)、細(xì)菌表型和外界因素的影響，可更準(zhǔn)確地同時(shí)檢測(cè)銅綠假單胞菌ESBLs、AmpC酶和金屬酶［5－6］。由表2可見(jiàn)，46.2%（30/65）菌株單產(chǎn)ESBLs，6.2%（4/65）菌株單產(chǎn) AmpC酶，15.4%（10/65）菌株同時(shí)產(chǎn)ESBLs和AmpC酶，23.1%（15/65）菌株同時(shí)產(chǎn)金屬酶和ESBLs，3.1%（2/65）菌株同時(shí)產(chǎn) AmpC酶和金屬酶，6.2%（4/65）菌株產(chǎn)其他β－內(nèi)酰胺酶，這與文獻(xiàn)［3，7－9］報(bào)道的有所不同，可能與各地區(qū)使用抗菌藥物的種類和頻率不同有關(guān)。本研究結(jié)果表明，本院耐頭孢他啶銅綠假單胞菌產(chǎn)ESBLs達(dá)84.7%，產(chǎn)金屬酶和 AmpC酶分別為26.2%和24.7%，而41.6%的菌株同時(shí)產(chǎn)兩種β－內(nèi)酰胺酶。說(shuō)明本院分離銅綠假單胞菌不僅產(chǎn)酶高，而且產(chǎn)酶種類較多，可能是對(duì)β－內(nèi)酰胺酶類藥物廣泛耐藥的重要機(jī)制，應(yīng)引起臨床高度重視。

綜上所述，本院耐頭孢他啶銅綠假單胞菌對(duì)β－內(nèi)酰胺酶類藥物耐藥主要與其產(chǎn)ESBLs有關(guān)，其次為AmpC酶和金屬酶?？刂飘a(chǎn)酶菌株在本院的播散及流行已刻不容緩，臨床在治療該類細(xì)菌感染時(shí)，應(yīng)及時(shí)根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選用抗菌藥物。

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