急性早幼粒細(xì)胞白血病PML維甲酸受體α融合基因定量檢測(cè)的應(yīng)用價(jià)值

林 綱，陳 蕾，焦志軍（江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇鎮(zhèn)江 212001）

急性早幼粒細(xì)胞白血?。ˋPL）是一種特殊類型的急性白血病，約占急性髓系白血?。ˋML）的10%～15%，多見于成人［1－2］。95%以上的APL患者具有t（15；17）（q22；q21）染色體易位，造成APL PML維甲酸受體α融合基因（PML－RARα）基因重排，形成特異性的PML－RARα，是檢測(cè)APL微小殘留?。∕RD）的重要分子標(biāo)志［3］。因PML基因的斷裂點(diǎn)不同，可以產(chǎn)生3種不同的PML－RARα異構(gòu)體，分別為長(zhǎng)型（L型）、短型（S型）和變異型（V型），其中以L型和S型較常見，V型較少見［4］。本文對(duì)臨床基因診斷實(shí)驗(yàn)室采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（RQ－PCR）檢測(cè)的12例初診APL患者PML－RARα的定量檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，以探討其在APL診斷、治療、預(yù)防復(fù)發(fā)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年2月至2012年2月于本院血液科初診的12例APL患者，其中男6例，女6例，年齡18～63歲，平均49.5歲。其中2012年2月診斷的1例新病例因初發(fā)治療完全緩解后尚未來本院復(fù)診，其余11例患者均完成預(yù)期治療方案，并從治療開始密切隨訪，隨訪時(shí)間14～50個(gè)月，平均28個(gè)月，先后共檢測(cè)融合基因106次。診斷和分期符合《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》（第3版）標(biāo)準(zhǔn)［5］。

1.2 骨髓PML－RARα檢測(cè) （1）單個(gè)核細(xì)胞分離和RNA提取：應(yīng)用淋巴細(xì)胞分離液（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司產(chǎn)品）分離新鮮乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝骨髓標(biāo)本得到單個(gè)核細(xì)胞，根據(jù)PML－RARα熒光定量試劑盒（上海申友生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品）說明書進(jìn)行總RNA提取。（2）逆轉(zhuǎn)錄和RQ－PCR：在15μL PCR反應(yīng)模板中加入含有逆轉(zhuǎn)錄酶的10μL PCR反應(yīng)液，42℃37min，94℃5min，94℃15s，60℃60s，循環(huán)40次，37℃1min。反應(yīng)在LightCycler PCR熒光檢測(cè)儀（德國(guó)羅氏公司產(chǎn)品）上進(jìn)行，其中ABL基因作為內(nèi)參照基因。（3）定量標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)定：PML－RARα陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品均為3×104、3×105、3×106、3×107copy/mL，ABL陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品均為3×103、3×104、3×105、3×106copy/mL。（4）結(jié)果判定：陰性對(duì)照的PML－RARα循環(huán)閾值（Ct）≥38或無擴(kuò)增曲線；臨界對(duì)照的濃度對(duì)數(shù)為3.83±0.50；陽(yáng)性對(duì)照的濃度對(duì)數(shù)為5.83±0.50者判定為陽(yáng)性。以標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，實(shí)際測(cè)得的Ct值為縱坐標(biāo)得到工作曲線，將待測(cè)標(biāo)本的Ct值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線即得到該基因的拷貝數(shù)。PML－RARα相對(duì)含量＝PML－RARα/ABL。如待測(cè)樣本中PML－RARα的Ct≥38或無擴(kuò)增曲線則判為陰性；內(nèi)參照基因ABL的Ct≥38或無擴(kuò)增曲線則判為降解。

1.3 細(xì)胞遺傳學(xué)檢查 取患者骨髓細(xì)胞培養(yǎng)24h后收獲制備染色體，核型分析采用R顯帶技術(shù)，按《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制（ISCN1995）》進(jìn)行核型分析。

1.4 血細(xì)胞分析 采集EDTA抗凝全血，Coulter LH750全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 PML－RARα定量檢測(cè)結(jié)果 12例初發(fā)患者均為陽(yáng)性，其中9 例 為 PML－RARα－L 陽(yáng)性，定 量 結(jié) 果 0.010 81～3.863 63；3例為 PML－RARα－S陽(yáng)性，定量結(jié)果0.032 95～0.092 89（表1）。隨訪的11例完全緩解（CR）患者長(zhǎng)期動(dòng)態(tài)檢測(cè)PML－RARα，均于誘導(dǎo)治療1～2個(gè)月內(nèi)達(dá)到血液學(xué)緩解，其中8例一直為CR，PML－RARα持續(xù)陰性；1例L型患者PML－RARα由0.143 24（初發(fā)）→0（CR1）→0.072 03（第1次CR1后13個(gè)月出現(xiàn)分子生物學(xué)復(fù)發(fā)）→0.234 61（第1次CR后13.5個(gè)月血液學(xué)復(fù)發(fā)）；1例S型患者PML－RARα由0.092 89（初發(fā)）→0（第1次CR）→0.126 71（第1次CR后40個(gè)月血液學(xué)復(fù)發(fā)），1例L型患者經(jīng)誘導(dǎo)治療2個(gè)月后雖達(dá)血液學(xué)CR，但PML－RARα－L持續(xù)陽(yáng)性呈逐漸下降趨勢(shì)。

表1 12例APL患者初診檢驗(yàn)結(jié)果

2.2 染色體核型分析結(jié)果 12例患者全部存在t（15；17），其中3例同時(shí)伴有其他染色體異常。1例t（15；17），＋21，＋13；1例t（15；17），Xq－；另1例t（15；17），t（1；x）（表1）。

2.3 其他實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)結(jié)果 細(xì)胞形態(tài)學(xué)分類以顆粒增多的早幼粒細(xì)胞為主，比例為54.0%～90.5%。白細(xì)胞計(jì)數(shù)7例降低（1.0×109/L～3.8×109/L）；1例正常（4.4×109/L）；4例增高：2例L型患者分別為30.7×109/L、37.8×109/L，2例S型患者分別為74.6×109/L、88.5×109/L（表1）。

3 討 論

RQ－PCR是在普通PCR中加入能與PCR產(chǎn)物結(jié)合的熒光探針或熒光染料，使之熒光信號(hào)隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加而呈比例增長(zhǎng)，儀器實(shí)時(shí)檢測(cè)每一個(gè)循環(huán)結(jié)束后的熒光強(qiáng)度，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比得出定量結(jié)果。從擴(kuò)增到產(chǎn)物分析都是閉管操作，最大限度地避免了污染，無PCR后處理。應(yīng)用RQ－PCR擴(kuò)增PML－RARα是檢測(cè)MRD最敏感的方法。隨訪的1例L型病例使用全反式維甲酸誘導(dǎo)治療第1次CR后13個(gè)月時(shí)檢測(cè)PML－RARα轉(zhuǎn)為陽(yáng)性（定量結(jié)果0.720 3），而與此同時(shí)骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)及遺傳學(xué)分別報(bào)告CR骨髓象和正常核型，當(dāng)該病例于13.5個(gè)月再次復(fù)查骨髓象報(bào)告APL復(fù)發(fā)、染色體分析出現(xiàn)t（15；17）時(shí)，PML－RARα－L定量檢測(cè)已高達(dá)0.234 61，超過該患者初診時(shí)的定量檢測(cè)結(jié)果（0.143 24），提示MRD檢測(cè)陽(yáng)性可預(yù)示惡性血液病的全面復(fù)發(fā)，應(yīng)盡早給患者行誘導(dǎo)治療，可避免發(fā)生血液學(xué)復(fù)發(fā)［6］。1例L型患者經(jīng)誘導(dǎo)治療2個(gè)月后血液學(xué)CR，PML－RARα－L持續(xù)陽(yáng)性，表達(dá)水平呈進(jìn)行性下降趨勢(shì)；1例S型患者誘導(dǎo)治療第1次CR至40個(gè)月時(shí)，持續(xù)陰性的PML－RARα－S轉(zhuǎn)為陽(yáng)性，定量結(jié)果為0.126 71，而此時(shí)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)報(bào)告僅為APL復(fù)發(fā)趨勢(shì)。以上信息分別提示APL患者誘導(dǎo)治療后融合基因比細(xì)胞形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)檢測(cè)指標(biāo)消失得更晚，而在復(fù)發(fā)時(shí)卻最先出現(xiàn)陽(yáng)性。RQ－PCR是目前最精確的檢測(cè)急性白血病MRD的方法，對(duì)APL患者PMLRARa表達(dá)量的測(cè)定及動(dòng)態(tài)變化監(jiān)測(cè)可獲知白血病細(xì)胞是否存在和不同治療方式的治療效果［7］。

PML－RARα是APL發(fā)病學(xué)和治療學(xué)的基礎(chǔ)，具有高度特異性。正常情況下，PML顯示類似腫瘤抑制基因的功能，RARα則促進(jìn)分化和抑制生長(zhǎng)活性。PML－RARα編碼的蛋白既破壞了核體的正常結(jié)構(gòu)，又通過與PML或其他維甲酸結(jié)合蛋白形成穩(wěn)定的二聚體，從而對(duì)野生型PML和RARα等位基因起顯性負(fù)調(diào)控作用，最終導(dǎo)致細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化［3］。本文檢測(cè)的12例初發(fā)APL患者100%為PML－RARα陽(yáng)性，其中L型9例（75%），S型3例（25%），與文獻(xiàn)［8］報(bào)道比例相仿，可能因病例數(shù)較少，本研究未發(fā)現(xiàn)V型陽(yáng)性患者。

95%以上的APL患者有t（15；17）染色體易位，并且該易位只見于APL患者，因此t（15；17）是APL高度特異性的細(xì)胞遺傳學(xué)標(biāo)志。12例APL患者100%（12/12）檢測(cè)到了t（15；17），其中25%（3/12）同時(shí)伴有其他染色體異常。該3例病例初診時(shí)融合基因的定量檢測(cè)結(jié)果均高于誘導(dǎo)治療后單純t（15；17）同期的定量檢測(cè)結(jié)果，提示染色體核型分析與融合基因的定量結(jié)果有一定的相關(guān)性，需進(jìn)一步擴(kuò)大病例來求證。不論是否有附加染色體異常，APL患者發(fā)病時(shí)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓早幼粒細(xì)胞比例等差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

12例APL患者初診時(shí)骨髓象早幼粒細(xì)胞增多，比例為54.0%～90.5%，有學(xué)者分析了42例APL有2例早幼粒細(xì)胞比例在50.0%以下，但幼稚細(xì)胞數(shù)量與PML－RARα的表達(dá)水平?jīng)]有相關(guān)性［9－10］。外周血白細(xì)胞總數(shù)大多表現(xiàn)為降低［10］，12例病例中L型和S型各有2例白細(xì)胞總數(shù)升高，且L型患者的白細(xì)胞總數(shù)明顯低于S型患者的白細(xì)胞總數(shù)。

總之，采用RQ－PCR方法跟蹤檢測(cè)PML－RARα可早期發(fā)現(xiàn)分子生物學(xué)復(fù)發(fā)情況，及時(shí)干預(yù)治療避免血液學(xué)復(fù)發(fā)。PML－RARα表達(dá)水平與病情進(jìn)展相一致，應(yīng)根據(jù)MRD水平正確評(píng)價(jià)治療效果，預(yù)測(cè)預(yù)后，制訂個(gè)體化治療方案。

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