死亡相關(guān)蛋白激酶1基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌中的臨床意義

李 琦，胡昌華，萬(wàn)光華，張 婧（.湖北省武漢市武漢科技大學(xué)附屬漢陽(yáng)醫(yī)院婦產(chǎn)科 430050；2.湖北省襄陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科 4402）

宮頸癌的發(fā)病機(jī)制主要與基因表達(dá)改變有關(guān)，表觀遺傳學(xué)在其發(fā)病機(jī)制中扮演重要角色，其中抑癌基因啟動(dòng)子甲基化引起的表觀遺傳學(xué)改變被認(rèn)為是最重要的發(fā)病機(jī)制［1－2］。死亡相關(guān)蛋白激酶1（DAPK1）為鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可正性調(diào)控細(xì)胞凋亡，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，在腫瘤中普遍存在高甲基化狀態(tài)［3－4］。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)宮頸癌組織和癌旁組織

DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，研究DAPK1基因在宮頸癌診斷、病情和預(yù)后評(píng)估中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 研究對(duì)象為2010年1月至2012年1月手術(shù)治療的80例初治宮頸癌患者，均經(jīng)癥狀體征、體格檢查、影像學(xué)及病理組織學(xué)檢查確診。年齡30～85歲，平均（50.6±15.4）歲；病理組織類型包括鱗狀細(xì)胞癌60例，腺癌12例，腺鱗癌8例；根據(jù)2009年國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）宮頸癌分期，其中Ⅰ期20，Ⅱ期35例，Ⅲ17例，Ⅳ期8例。

1.2 方法 檢測(cè)標(biāo)本均取宮頸癌患者手術(shù)切除腫瘤組織和距腫瘤組織大于5cm癌旁組織，標(biāo)本取材后立即置于液氮中保存。DNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。引物由大連寶生物工程有限公司合成。甲基化修飾試劑盒購(gòu)于北京天漠公司。DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化MSP檢測(cè)，按基因組DNA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，提取宮頸癌組織和癌旁正常組織總DNA。按甲基化試劑盒說(shuō)明書(shū)采用重亞硫酸鹽將提取的DNA未甲基化C轉(zhuǎn)化為U，轉(zhuǎn)化后的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物采用Methyl Primer Express V1.0設(shè)計(jì)，序列見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)體系為25μL，循環(huán)條件為：95℃預(yù)變性10min，95℃變性1min，65℃退火45s，72℃延伸45s，共35個(gè)循環(huán)，最后一輪72℃延伸10min。擴(kuò)增后的產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后檢測(cè)。

表1 RASSF1A基因MSP甲基化引物

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Sigmaplot 11.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確計(jì)算P值。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α＝0.05，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌組織和癌旁組織檢測(cè)結(jié)果 80例患者中宮頸癌組織有50例DAPK1基因啟動(dòng)子呈甲基化狀態(tài)，甲基化率為62.5%，癌旁組織中有4例DAPK1基因啟動(dòng)子呈甲基化狀態(tài)，甲基化率為5.0%，宮頸癌組織中DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于宮頸癌癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 RASSF1A基因啟動(dòng)子甲基化MSP結(jié)果

2.2 DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系 見(jiàn)表2。宮頸癌癌組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率在年齡和病理中差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在組織學(xué)分級(jí)、腫瘤最大徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、器官轉(zhuǎn)移、FIGO分期中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），組織學(xué)分級(jí)高、腫瘤最大徑大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及器官轉(zhuǎn)移、FIGO分期晚的癌組織DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率高于組織學(xué)分級(jí)低、腫瘤最大徑小、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及器官轉(zhuǎn)移、FIGO分期早的癌組織。

表2 DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化與臨床病理因素的關(guān)系

3 討 論

基因甲基化是最重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，真核生物的DNA中高達(dá)80%的CpG位點(diǎn)發(fā)生甲基化改變，這些甲基化主要分布在基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島，CpG位點(diǎn)的甲基化可引起染色體及DNA空間構(gòu)象發(fā)生改變，主動(dòng)或被動(dòng)阻遏轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合到轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)而調(diào)控基因表達(dá)［5］。研究表明，基因啟動(dòng)子甲基化與腫瘤的發(fā)病機(jī)制、病情及預(yù)后緊密相關(guān)，可作為腫瘤的基因水平生物學(xué)標(biāo)志物，較傳統(tǒng)的蛋白水平的腫瘤標(biāo)志物具有更高的靈敏度及特異性［6］。DAPK1作為新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，具有鈣調(diào)蛋白調(diào)節(jié)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的作用，可正性調(diào)控細(xì)胞的凋亡，在各種細(xì)胞凋亡系統(tǒng)中扮演重要角色，被證實(shí)與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移緊密相關(guān)，其啟動(dòng)子高甲基化改變?cè)谌橄侔┘跋到y(tǒng)均可檢測(cè)到［7－8］，在人乳頭瘤病毒誘導(dǎo)發(fā)生的宮頸癌組織中其甲基化高達(dá)56.3%［9］。本研究中，宮頸癌組織中DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率為62.5%，癌旁組織中甲基化率為5.0%，宮頸癌組織中DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率顯著高于宮頸癌癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），由此證實(shí)DAPK1基因在宮頸癌中存在高甲基化狀態(tài)。

研究表明，抑癌基因的表觀遺傳學(xué)改變?cè)谀[瘤的診斷、病情評(píng)估和預(yù)后評(píng)估中扮演重要角色，越來(lái)越多的基因被發(fā)現(xiàn)在腫瘤診斷中表現(xiàn)出極高的靈敏度及特異性。在本研究中，組織學(xué)分級(jí)高、腫瘤最大徑大、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及器官轉(zhuǎn)移、FIGO分期晚的宮頸癌組DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化率高于組織學(xué)分級(jí)低、腫瘤最大徑小、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及器官轉(zhuǎn)移、FIGO分期早的癌組織，提示DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化在宮頸癌病情及預(yù)后評(píng)估中具有重要作用。腫瘤的組織學(xué)分級(jí)及分期是公認(rèn)的與腫瘤病情及預(yù)后相關(guān)的因素，分化程度越低、分期越晚，患者病情越重，預(yù)后越差，生存時(shí)間越短，質(zhì)量越差，基于這個(gè)事實(shí)，本文認(rèn)為DAPK1基因啟動(dòng)子甲基化可以作為宮頸癌基因水平的生物學(xué)標(biāo)志物，可為宮頸癌的診斷、病情與預(yù)后評(píng)估提供證據(jù)，盡管較目前的蛋白質(zhì)生物學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)繁瑣，隨著檢測(cè)水平的提高，會(huì)越來(lái)越體現(xiàn)出高靈敏度及特異性等優(yōu)點(diǎn)。

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