免疫后發(fā)病仔豬中偽狂犬病毒的分離和鑒定

童 武，張青占，鄭 浩，劉 飛，姜一峰，單同領，周艷君，童光志

（中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

偽狂犬病是由偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的以發(fā)熱、奇癢、腦脊髓炎為主要特征的一種烈性傳染病[1]。豬是偽狂犬病毒的天然宿主、貯存者和傳播者[1,2]。此病對養(yǎng)豬業(yè)危害極大，常在豬群中爆發(fā)流行。該病毒可感染各個年齡段的豬，主要引起妊娠母豬流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎、哺乳仔豬高死亡率及種豬不育。除了使新生仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀外，PRV還可以侵害免疫系統(tǒng)[3]，使其容易繼發(fā)其他疾病，如藍耳?。╬orcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）[4]。偽狂犬最早在美國發(fā)生，我國于上世紀40年代末在貓中首次發(fā)現(xiàn)了偽狂犬病毒，60年代初在豬群中也出現(xiàn)了該病毒流行。目前，偽狂犬病毒在我國廣泛流行，嚴重威脅著豬群的健康[5]，并造成了嚴重經(jīng)濟損失[6]。

偽狂犬病毒屬于皰疹病毒科甲型皰疹病毒亞科，能感染多種宿主。豬感染PRV后，有的呈隱性感染，但長期攜帶病毒；出現(xiàn)臨床癥狀的耐過豬也能成為病毒的攜帶者，成為傳染源，這增加了PRV防治的難度[7,8]。部分歐洲國家宣布通過接種基因缺失弱毒疫苗及相應的血清學診斷技術的監(jiān)測根除了偽狂犬 (Decision 2011/648/EU, Annex I)，而由于野生動物的感染與攜帶，歐洲大陸國家仍難以實現(xiàn)PRV根除[9-11]。我國也廣泛使用PRV基因缺失弱毒疫苗來防控該病。但自2011年以來，許多使用gE基因缺失活疫苗免疫的規(guī)?；i場出現(xiàn)了母豬產(chǎn)弱仔、死胎、流產(chǎn)，仔豬出現(xiàn)神經(jīng)癥狀及死亡等疑似偽狂犬的臨床癥狀。本實驗室從江蘇某疑似偽狂犬的發(fā)病豬場進行了PRV流行毒株的檢測及分離鑒定，結(jié)果表明該豬場存在偽狂犬病毒野毒感染，且疫苗不能提供完全的保護。對該病毒的分離鑒定及生物特性分析，有利于進一步認清流行病毒的特征，為控制該病的傳播和蔓延以及進一步研制新型疫苗打下基礎。

1 材料與方法

1.1 病料病料來源于江蘇省某發(fā)病豬場，該豬場接種PRV基因缺失弱毒疫苗，但出現(xiàn)疑似偽狂犬病癥狀。兩頭瀕臨死亡的7日齡新生仔豬，取其心、肝、脾、肺、腎、腦、腹股溝淋巴結(jié)、小腸及內(nèi)容物和血液等病料進行反復凍融研磨離心，將上清液分裝保存。

1.2 試劑 細胞 陽性血清及小鼠LATaqDNA聚合酶，dNTP mix，2×GC Buffer I，pMD18-T Vector，DL2000 DNA Marker等為寶生物工程（大連）有限公司生產(chǎn)；DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；膠回收試劑盒購自OMEGA公司；胎牛血清（fetal bovine serum, FBS） 和 DMEM 培養(yǎng)基為 Invitrogen公司產(chǎn)品；Vero細胞由上海獸醫(yī)研究所豬病實驗室保存，以含10% FBS的DMEM培養(yǎng)；PRV Barthak61疫苗株陽性豬血清、HeN1株陽性豬血清[12]及PRV經(jīng)典強毒S株由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病研究室饋贈；BALB/c小鼠購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

1.3 引物參照 GenBank 中 PRV Becker株的全基因組序列（GenBank:JF797219），設計了分別針對gB基因和gE基因的兩對引物:gB up/gB down和gE up/gE down，用于 PCR 檢測 PRV。同時，設計一對引物gEF/gER，用于擴增gE全長基因序列，以作進化分析。引物均由上海捷瑞生物科技有限公司合成，引物序列如表1。

表1 用于PRV病毒鑒定和gE基因擴增的引物Table 1 The primers for detecting PRV and amplifi cation of gE gene

1.4 病毒核酸的提取及PCR參照說明書，以QIAGEN組織／細胞基因組DNA提取試劑盒提取核酸。PCR 反應體系:LATaqDNA 聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，2×GC Buffer Ⅰ 25 μL，dNTP mixture（各 2.5 mM）8 μL，上下游引物各 1 μL，模版DNA 2μL，補水至50 μL。反應程序為:95℃預變性 5 min; 94℃ 1 min，退火 1 min，72℃延伸，35 個循環(huán); 最后72℃延伸10 min。其中，檢測gE和gB退火溫度分別為64℃和68℃，延伸1 min；gE全基因擴增退火64℃，延伸2 min。用1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測回收PCR 產(chǎn)物。

1.5 病毒的分離與純化將PCR檢測陽性病料組織研磨液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，取0.5 mL接種單層Vero細胞，37℃孵育1 h后棄接種液，加入含2%FBS的DMEM培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并觀察細胞病變。待70%左右的細胞發(fā)生病變時收毒，凍融后離心取上清，接種Vero細胞再傳2次。提取收獲液中的 DNA，以 gB up/ gB down 和 gE up/ gE down 兩對引物進行PCR檢測。

將收獲的病毒液以DMEM作1：10稀釋至10-6，稀釋病毒以1 mL接種60 mm培養(yǎng)平皿中的融合單層Vero細胞，37℃孵育1 h后棄接種液，并以DMEM洗2次，每平皿加入12 mL覆蓋培養(yǎng)層（含1%瓊脂糖和2% FBS）。37℃培養(yǎng)48 h后，挑起單個空斑于0.5 mL DMEM中?？瞻咭悍磸蛢鋈?次，以DMEM稀釋并接種Vero細胞，作下一輪空斑純化。將經(jīng)過6輪空斑純化的空斑液接種T25培養(yǎng)瓶中的Vero細胞，擴大培養(yǎng)。收獲病毒液分裝于1.5 mL離心管，凍存于-75℃。

1.6 IFA鑒定將分離病毒接種6孔板中的Vero細胞，36 h后，棄培養(yǎng)液，以預冷的80%乙醇4℃固定1 h，分別加1：500稀釋的HeN1株陽性豬血清及1：200稀釋的Barthak61株陽性豬血清各1 mL，37℃孵育1 h，PBS洗滌后用FITC標記兔抗豬抗體37℃孵育1 h。用DAPI（0.2 μg/mL）對細胞核進行染色后置熒光顯微鏡下觀察。

1.7 電鏡觀察將病毒液以 130 000×g超速離心 2 h，以STE緩沖液重懸沉淀，用2%磷鎢酸負染，在電鏡下觀察病毒粒子形態(tài)。

1.8 病毒滴度測定將病毒液稀釋成 10-1～10-10，分別接種到96孔培養(yǎng)板中長成融合單層的Vero上，每個稀釋度接種8孔，培養(yǎng)板最后兩列孔接種稀釋液作對照，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，96 h后觀察細胞病變，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50[12]。

1.9 動物試驗6周齡BALB/c小鼠70只，分為兩組。第一組 35只，分別接種含101.0～106.0TCID50的分離病毒稀釋液，每個稀釋度5只，每只腹股溝皮下注射0.1 mL。同時以5只小鼠注射DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照。第二組35只小鼠，接種PRV S株，按照第一組方法進行。接種后每天觀察小鼠臨床癥狀及死亡情況，按照Reed和Muench法計算病毒的半數(shù)致死量（LD50）[13]。

1.10 病毒的遺傳變異性分析提取純化分離病毒的基因組DNA，以gEF/gER為引物，PCR擴增完整的gE基因編碼區(qū)。膠回收目的片段，連接pMD18-T載體后選擇陽性質(zhì)粒測序，并用生物學軟件進行進化分析。

2 結(jié)果

2.1 病料檢測對仔豬組織勻漿液進行反復凍融，提取總DNA，用gB和gE的特異性引物進行PCR檢測，結(jié)果如圖1所示。在檢測的8個組織中，僅腦組織樣品中能擴增出與陽性對照大小相一致片段，分別為633 bp和366 bp。這顯示，腦組織中可能存在PRV感染。由于該豬場使用的疫苗株缺失gE基因，gE基因陽性表明感染PRV為野毒株。

2.2 病毒的分離將PRV陽性病料組織研磨液經(jīng)0.22 μm濾器過濾后，接種至單層Vero細胞，36 h后觀察到了典型的細胞病變，細胞聚集、變圓、脫落，有的形成合胞體（圖2）。提取DNA做PCR檢測，gB up/ gB down 和 gE up/ gE down 兩對引物均能擴增出特異性目的片段（圖3，圖4），這表明從病料中分離出的PRV為野毒株，并命名為JS-2012株。

圖1 組織樣品偽狂犬病毒PCR檢測結(jié)果Fig.1 The results of PCR detecting samples for PRV

圖2 病料腦組織勻漿上清液感染Vero細胞引起的細胞病變Fig.2 Cytopathogenic effects of Vero cells inoculated with homogenated brain tissue supernatant

圖3 gB up/ down的PCR鑒定病毒結(jié)果Fig.3 PCR detecting the isolated virus with gB up/ down

圖4 gE up/ down的PCR鑒定病毒結(jié)果Fig.4 PCR detecting the isolated virus with gE up/ down

2.3 病毒的IFA鑒定分離病毒感染Vero后，用PRV Barthak61株和HeN1株陽性血清做IFA檢測。如圖5所示，病毒感染能產(chǎn)生典型合胞體病變，合胞體能與PRV陽性血清作用，顯示強烈熒光，這證實分離病毒確為PRV。兩種血清均能和分離病毒作用，顯示特異性熒光，但使用HeN1株陽性血清的熒光亮度強于Bartha k61毒株。

圖5 病毒的間接免疫熒光檢測結(jié)果Fig.5 IFA identifi cation of the isolated virus

2.4 病毒粒子形態(tài)將分離病毒超速離心并負染，在電鏡下觀察，可發(fā)現(xiàn)典型的偽狂犬病毒粒子形態(tài)（圖6）。病毒粒子呈球形，直徑在160 nm左右，有明顯的核芯和正二十面體的核衣殼結(jié)構，囊膜表面有明顯的放射狀纖突。這進一步證實分離的病毒是偽狂犬病毒。

圖6 病毒粒子的電鏡觀察Fig.6 The morphology of virions

2.5病毒滴度將純化后的JS-2012株接種Vero細胞進行病毒擴增，以96孔板中的Vero細胞測定了病毒滴度。JS-2012株感染Vero細胞，病毒滴度可達107.43TCID50/ mL。

2.6小鼠感染試驗將PRV S株和分離株JS-2012接種BALB/c小鼠，分別在d 3和d 4出現(xiàn)典型的偽狂犬病癥狀；注射部位奇癢、不斷啃咬、導致皮膚出血、毛發(fā)蓬亂、脫落，并開始出現(xiàn)死亡。接種JS-2012 103.0～106.0TCID50的小鼠和 PRV S 104.0～106.0TCID50的都在接種后5 d內(nèi)出現(xiàn)死亡，其后不再發(fā)病與死亡。計算兩者對BALB/c小鼠的半數(shù)致死量（LD50），PRV JS-2012 株 為 102.37TCID50，PRV S 株 為 103.37TCID50。注射同等劑量DMEM培養(yǎng)液的對照小鼠沒有異常表現(xiàn)。結(jié)果表明，PRV JS-2012株的半數(shù)致死量要低于PRV S經(jīng)典強毒株。

2.7 病毒gE基因的擴增及其進化分析以gEF/gER為引物，擴增出了包含完整gE基因序列的約1700 bp片段（圖7）。測序并分析發(fā)現(xiàn)gE基因全長為1740 bp。利用生物學軟件DNAStar對JS-2012gE核苷酸序列與其他毒株序列進行比對，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同毒株之間同源性很高，但JS-2012和2012年新分離的毒株位于一個相對獨立的分支中，而與以前分離的毒株親緣關系相對較遠（圖8）。核酸序列比對發(fā)現(xiàn)，除Ea株外，JS-2012和其他毒株相比，存在2個位點上3個連續(xù)堿基的插入。與Ea株相比，JS-2012只在1個位置存在3個連續(xù)堿基的插入，導致在編碼的氨基酸序列上增加1個冬氨酸殘基，其他位置上存在不同程度的堿基替換。

圖7 gE全長基因的PCR擴增結(jié)果Fig.7 PCR products of gE gene

圖8 PRV gE基因的進化樹分析Fig.8 Phylogenetic analysis of PRV gE sequence

3 討論

本研究通過采集PRV弱毒疫苗免疫豬場疑似偽狂犬發(fā)病仔豬病料，將PCR檢測陽性病料接種細胞，并通過免疫熒光和電鏡形態(tài)觀察，證實從發(fā)病仔豬腦組織中分離出1株PRV野毒株，且該野毒株比PRV經(jīng)典株S株對小鼠的LD50低。對gE基因的進化分析發(fā)現(xiàn)，該野毒株與新近分離的毒株遺傳關系近，與以前分離的毒株遺傳關系較遠。

由于PRV基因缺失弱毒疫苗的推廣應用，該病在我國豬場顯著降低，也有一些國家通過接種基因缺失弱毒疫苗及相應的血清學診斷技術的監(jiān)測，實現(xiàn)了偽狂犬根除。然而，2011年開始，我國不同省份多個豬場出現(xiàn)接種PRV弱毒疫苗仍發(fā)生偽狂犬的現(xiàn)象。2012年下半年，江蘇省某豬場也發(fā)生接種基因缺失弱毒疫苗后仔豬出現(xiàn)疑似偽狂犬癥狀。我們采取了該豬場發(fā)病仔豬病料，對偽狂犬病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒等常見病原進行了PCR檢測，結(jié)果僅偽狂犬病毒陽性。從病料中，我們也成功分離出1株PRV野毒株JS-2012。這顯示，該豬場存在PRV野毒感染而導致仔豬發(fā)病，而使用的疫苗不能提供有效保護。我們擴增了野毒株JS-2012的gE基因全序列，進化分析顯示，JS-2012株與新近分離株處于一個相對獨立的分支中，遺傳關系近，而與以前分離株遺傳關系遠。這表明，與以前分離株相比，當前流行株發(fā)生一定程度變異。因此，豬場中變異株的出現(xiàn)，可能導致了疫苗免疫失敗的發(fā)生。我們測定了JS-2012株和PRV經(jīng)典毒株S株對BALB/c小鼠的LD50，結(jié)果顯示，接種后JS-2012株接種組小鼠比S株組發(fā)病時間和死亡時間要晚，但JS-2012株的LD50比S株的低。這表明JS-2012株與S株對小鼠的致病特征不同，單從致死率來看，JS-2012株比S株毒力強。是否因流行株變異導致毒力增強而突破現(xiàn)有疫苗的保護呢？這尚不能確定。如果流行株發(fā)生重要抗原變異，也可能導致疫苗免疫失敗。因此，還需要對流行株作更廣泛和深入的研究，尋找病毒基因組的變異區(qū)域，研究變異給病毒毒力和抗原帶來的影響，從而確定導致現(xiàn)有疫苗免疫失敗的原因，為豬場防控PRV提供理論和技術支持。

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