吡咯烷二硫氨基甲酸對大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

唐 華，陳 蓉，張春梅，王順蓉，萬 英

急性腎損傷(acute kidney injury，AKI)是目前臨床上患病率和病死率均較高的常見危重癥，其機(jī)制涉及炎癥免疫反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷等［1］。核因子-кB(nuclear factor-кB，NF-кB)作為調(diào)控多種炎癥介質(zhì)基因表達(dá)的樞紐，在AKI的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［2］。吡咯烷二硫氨基甲酸(pyrrolidine dithiocarbamat，PDTC)既是一種抗氧化劑，又是 NF-кB 的特異抑制劑，對心、肝、肺和腎臟多種疾病均具有保護(hù)作用［3-6］，但在AKI中的作用鮮有報(bào)道。本研究通過缺血性AKI大鼠模型，觀察PDTC對NF-кB下游炎癥因子及腎臟氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，探討PDTC對AKI的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量250～300 g，清潔級，由瀘州醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供［合格證號:SCYK(川)2006-0004］。

1.1.2 主要試劑 NF-кB抑制劑PDTC購自Sigma公司，兔抗大鼠NF-кB p65多克隆抗體和辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase，HRP)標(biāo)記的羊抗兔二抗購自美國Santa-Scruz公司，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光(enhanced chemi luminescence，ECL)檢測試劑盒購自美國Pierce公司，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)雙抗體夾心法試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，丙二醛及總抗氧化能力檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 模型建立與分組 大鼠用戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔麻醉，腹部正中切口，分離腎動(dòng)靜脈，用無創(chuàng)動(dòng)脈夾夾閉雙側(cè)腎動(dòng)脈，60min后松夾計(jì)時(shí)，關(guān)閉腹腔切口。大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(假手術(shù)組不夾閉腎動(dòng)脈，從關(guān)腹開始計(jì)時(shí))、AKI組和PDTC組，AKI組和PDTC組松夾后及假手術(shù)組按取材時(shí)間又分為3、6、12、24、48 h 組，每組 6 只。PDTC 組在松夾前0.5 h腹腔注射PDTC 100 mg/kg，假手術(shù)組和AKI組分別注射等量生理鹽水。

1.3 標(biāo)本采集 于取材各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，取腔靜脈血3 ml，用于檢測血清肌酐(serum creatinine，SCr)和尿素氮(blood urea nitrogen，BUN);同時(shí)切除左腎，取部分腎組織常規(guī)制片，蘇木素和伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色觀察腎臟病理改變;其余腎組織經(jīng)液氮迅速冷卻后置于-80℃冰箱保存待測。

1.4 腎細(xì)胞核內(nèi) NF-кB p65蛋白的表達(dá) 采用Western blotting法進(jìn)行檢測。提取腎組織勻漿的核蛋白，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法定量。制備12%分離膠和6%濃縮膠，蛋白上樣量10μg。泳畢將蛋白電轉(zhuǎn)移至聚偏氯乙烯(polyvinylidendfluoride，PVDF)膜，用含5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的1×三羥甲基氨基甲烷-Tween緩沖液(tris buffered saline with tween-20，TBST)封閉過夜，加入NF-кB p65兔抗大鼠多克隆抗體(稀釋比例1∶800)，37℃孵育2 h;加入HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(稀釋比例1∶2000)，37℃孵育 1.5 h;以 βactin為內(nèi)參照ECL試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，最后用凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)自動(dòng)曝光、掃描，獲得各蛋白帶條光強(qiáng)度值(intensity，INT)。蛋白相對表 達(dá) 量 INT'= INT'各處理組/INT'假手術(shù)組，INT'=INT目的蛋白/INTβ-actin。

1.5 腎組織腫瘤壞死因子-α和細(xì)胞間黏附分子-1的表達(dá) 按照ELISA雙抗體夾心法試劑盒說明進(jìn)行腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和細(xì)胞間黏附分子-1(intercellular adhesionmolecule-1，ICAM-1檢測。

1.6 腎組織丙二醛水平和總抗氧化能力檢測 采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)法測定腎組織勻漿中丙二醛(malondialdehyde，MDA)水平，鐵還原法測定腎組織勻漿中總抗氧化能力(total-antioxidative capacity，T-AOC)，均按試劑盒進(jìn)行操作。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，單因素方差分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，各組間兩兩比較用LSD法(方差齊時(shí))或Dunnett's T3法(方差不齊時(shí))，并檢驗(yàn)NF-кB p65蛋白表達(dá)量分別與TNF-α、ICAM-1、MDA和T-AOC的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 腎功能和組織學(xué)檢查 AKI組各時(shí)間點(diǎn)血清SCr及BUN水平較假手術(shù)組顯著增高(P＜0.01);而PDTC組兩者水平較AKI組明顯降低(P＜0.05，P＜0.01)，但仍然高于假手術(shù)組(P＜0.05)。AKI組和PDTC組隨著恢復(fù)灌流時(shí)間的延長，SCr及BUN水平均逐漸增高(表1)。

假手術(shù)組腎臟組織結(jié)構(gòu)正常。AKI組腎臟病理變化明顯，鏡下見腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、壞死、脫落，管腔內(nèi)各種管型，腎間質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤。PDTC組腎臟病變比AKI組明顯減輕(圖1)。

表1 各組30例血清SCr和BUN水平±s)

表1 各組30例血清SCr和BUN水平±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P＜0.01;與 AKI組比較，#P＜0.05，★P＜0.01

SCr(μmol/L)BUN(mmol/L)組別3h 6h 12h 24h 48h3h 6h 12h24h 48h假手術(shù)組 52.03±3.65 52.93±5.65 56.79±3.92 54.19±4.00 56.94±3.09 7.47±0.24 7.50±0.63 7.68±0.71 7.54±0.62 7.85±1.13 AKI組 145.51±15.94△ 163.06±17.49△ 219.09±11.11△ 254.79±19.09△ 298.76±13.80△ 12.59±1.04△ 17.93±3.02△ 24.51±2.99△ 30.18±1.92△ 45.77±3.19△PDTC組 70.16±3.04△★ 81.70±3.58△★ 104.04±9.38△★ 138.14±12.40△★ 166.75±13.00△★ 7.98±0.35★ 10.95±0.51△# 13.89±0.85△★ 19.88±1.21△★ 28.52±0.76△★

圖1 各組組織病理學(xué)改變(HE×600)

2.2 腎組織細(xì)胞核內(nèi)NF-кBp65蛋白表達(dá) AKI組各時(shí)間點(diǎn)腎細(xì)胞核內(nèi)NF-кBp65蛋白的表達(dá)均較假手術(shù)組明顯增高(P＜0.01)，而同期PDTC組的表達(dá)較AKI組顯著降低(P＜0.01)。AKI組和PDTC組NF-кBp65蛋白表達(dá)均在恢復(fù)灌流3h達(dá)到高峰，之后略有下降，于恢復(fù)灌流24h表達(dá)再次上調(diào)(圖 2，表 2)。

圖2 各組腎組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白表達(dá)(ˉ±s，n=6)

表2 各組30例腎組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白相對表達(dá)量)

表2 各組30例腎組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κBp65蛋白相對表達(dá)量)

注:與假手術(shù)組比較，△P＜0.01;與 AKI組比較，★P＜0.01

組別 3h 6h 12h 24h 48h假手術(shù)組 1.01±0.15 1.03±0.23 0.97±0.06 0.99±0.09 1.00±0.10 AKI組 4.06±0.51△ 2.91±0.44△ 1.49±0.34△ 1.93±0.21△ 2.47±0.34△PDTC組 2.02±0.24△★ 1.26±0.23★ 1.11±0.18★ 1.33±0.10△★ 1.36±0.25△★

2.3 腎組織TNF-α和ICAM-1表達(dá)變化 AKI組各時(shí)間點(diǎn)TNF-α和ICAM-1的表達(dá)均較假手術(shù)組明顯增高(P＜0.01)，而PDTC組兩種細(xì)胞因子的表達(dá)均顯著低于AKI組(P＜0.01)。AKI組和PDTC組兩種因子均在恢復(fù)灌流3h表達(dá)達(dá)到高峰，TNF-α表達(dá)在恢復(fù)灌流6h稍有下調(diào)，之后表達(dá)再次增高;ICAM-1表達(dá)在恢復(fù)灌流3h達(dá)到高峰后，于6h和12h表達(dá)下降，表達(dá)再次上調(diào)出現(xiàn)在24h(表3)。

2.4 腎組織MDA和T-AOC變化 與假手術(shù)組相比，AKI組和PDTC組MDA水平升高(P＜0.01)，TAOC降低;而與AKI組同一時(shí)間點(diǎn)比較，PDTC各組MDA水平降低(P＜0.01)，T-AOC增高。AKI組和PDTC組MDA水平均于恢復(fù)灌流3～12h稍有下降，于24～48h再次增高;而T-AOC變化趨勢與此相反，于恢復(fù)灌流3～12h活性略有升高，于24～48h活性再次降低(表4)。

表3 各組30例腎組織TNF-α和ICAM-1表達(dá)變化(±s)

表3 各組30例腎組織TNF-α和ICAM-1表達(dá)變化(±s)

注:與假手術(shù)組比較，#P＜0.05，△P＜0.01;與 AKI組比較，★P＜0.01

組 別TNF-α (μg/kg)3h 6h 12h 24h 48h ICAM-1(μg/kg)3h 6h 12h 24h 48h假手術(shù)組 1.59±0.05 1.23±0.32 1.04±0.04 1.68±0.27 1.00±0.31 0.91±0.03 0.84±0.06 0.66±0.12 0.89±0.08 0.77±0.05 AKI組 6.89±0.43△ 6.01±0.11△ 6.35±0.24△ 6.67±0.31△ 7.34±0.64△ 1.92±0.13△ 1.52±0.08△ 1.27±0.09△ 1.73±0.12△ 2.23±0.10△PDTC組 4.04±0.38△★ 2.99±0.10△★ 3.24±0.05△★ 3.97±0.17△★ 4.58±0.08△★ 1.24±0.05△★ 0.99±0.17#★ 0.87±0.06△★ 1.06±0.12△★ 1.37±0.04△★

表4 各組30例腎組織MDA和T-AOC檢測±s)

表4 各組30例腎組織MDA和T-AOC檢測±s)

注:與假手術(shù)組比較，△P＜0.01;與 AKI組比較，★P＜0.01

組 別MDA(μmol/g)3h 6h 12h 24h 48h T-AOC(U/mg)3h 6h 12h 24h 48h假手術(shù)組 0.88±0.04 0.83±0.03 0.85±0.07 0.81±0.21 0.92±0.13 2.01±0.08 1.99±0.04 2.01±0.13 2.00±0.11 2.07±0.11 AKI組 3.47±0.42△ 3.31±0.06△ 3.00±0.19△ 3.58±0.22△ 3.72±0.19△ 0.55±0.14△ 0.66±0.06△ 0.73±0.17△ 0.59±0.13△ 0.47±0.20△PDTC組 2.04±0.35△★ 1.83±0.21△★ 1.46±0.05△★ 2.00±0.21△★ 2.47±0.16△★ 0.87±0.09△★ 1.24±0.07△★ 1.53±0.12△★ 1.15±0.17△★ 1.00±0.07△★

2.5 腎組織細(xì)胞核內(nèi)NF-кB P65蛋白表達(dá)變化與其他指標(biāo)相關(guān)性分析 腎細(xì)胞核內(nèi)NF-кB p65蛋白表達(dá)分別與TNF-α和ICAM-1的表達(dá)呈正相關(guān)(r分別為0.487、0.614，P＜0.01)，與MDA 水平也呈正相關(guān)(r=0.436，P＜0.01)，而與 T-AOC活性呈負(fù)相關(guān)(r=-0.283，P＜0.01)。

3 討論

在腎臟手術(shù)、腎移植、急性缺血等原因所致腎臟低灌注過程中，腎小球?yàn)V過率急劇下降，可引起缺血性AKI。目前臨床上 AKI患者病死率高達(dá)30%～50%［7］，對AKI患者進(jìn)行積極有效的防治是臨床醫(yī)生面臨的重要問題。

研究表明，由NF-кB調(diào)控的涉及 TNF-α、ICAM-1等多種炎癥介質(zhì)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)在AKI過程中發(fā)揮重要作用［8］。NF-кB的活性可以進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的p65亞單位來間接反映。PDTC既是一種抗氧化劑，又是NF-кB的特異抑制劑，可在NF-кB活化通道的不同水平發(fā)揮抑制作用，如抑制NF-кB p65亞單位，抑制卡巴B 蛋白(inhibition of kaba B protein，IкB)的降解，減少 NF-кB 核轉(zhuǎn)位等［9］。本研究顯示，AKI時(shí)NF-кB的活性與TNF-α和ICAM-1的表達(dá)變化呈正相關(guān)，均在恢復(fù)灌流3～48 h顯著增高;而PDTC組抑制NF-кB活化后，TNF-α和 ICAM-1表達(dá)明顯減少，同時(shí)血清SCr和BUN明顯降低，腎臟組織病理學(xué)損傷也減輕。表明PDTC可能通過抑制NF-кB，降低腎組織中TNF-α和ICAM-1表達(dá)量，減輕AKI所致的炎癥級聯(lián)反應(yīng)，改善早期腎功能。

據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激可與炎癥反應(yīng)相互影響，參與AKI過程，其共同的樞紐也在于NF-кB。AKI時(shí)，局部產(chǎn)生的氧自由基可激活NF-кB轉(zhuǎn)位入核，誘導(dǎo)相關(guān)炎癥基因的表達(dá)，而炎性損傷的細(xì)胞可進(jìn)一步產(chǎn)生大量活性氧分子，加重脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷［10］。MDA是脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物，而 TAOC代表組織的總抗氧化能力，兩者可較好地反映組織氧化應(yīng)激損傷程度。本研究顯示，AKI組較假手術(shù)組 MDA增多，T-AOC降低;而 PDTC組隨著NF-кB活性的降低，MDA減少，T-AOC增高，且NFкB活性分別與MDA和T-AOC的變化呈正、負(fù)相關(guān)。表明PDTC能通過抑制NF-кB活性，減輕AKI的氧化應(yīng)激損傷。

綜上所述，PDTC對缺血性AKI具有保護(hù)作用，其效應(yīng)可能與抑制NF-кB活化，從而減少下游炎癥因子TNF-α和ICAM-1的產(chǎn)生，以及減輕氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。這為缺血性AKI的臨床防治開辟了又一新途徑。

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