十全大補湯調(diào)整肉桂劑量對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響

郝鈺 唐瑩 王順梅 杜貫潮 代紅雨

十全大補湯調(diào)整肉桂劑量對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響

郝鈺 唐瑩 王順梅 杜貫潮 代紅雨

目的 從細胞分裂周期變化角度探討十全大補湯調(diào)整肉桂劑量促進創(chuàng)面修復(fù)及皮膚修復(fù)的機理。方法 采用體外培養(yǎng)成纖維細胞，造成氧化損傷成纖維細胞模型。以血清藥理學方法獲取大鼠血清，用以對成纖維細胞模型的干預(yù)。并運用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應(yīng)比色法（MMT法）及流式細胞儀檢測成纖維細胞增殖及分裂周期的變化。結(jié)果 MMT法結(jié)果顯示2倍肉桂組和4倍肉桂組對氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞具有促進增殖的作用，與模型組比較差異顯著（P＜0.01）；流式細胞術(shù)結(jié)果顯示經(jīng)500μmol／L的H2O2刺激30分鐘的大鼠真皮成纖維細胞中G0／G1期細胞比例顯著增高，S期和G2／M期細胞比例顯著降低。在藥物干預(yù)24小時后，四個用藥組均可降低G0／G1期細胞比例，S期和G2／M期細胞比例升高；在藥物干預(yù)48小時后，除了去肉桂組以外，其余三個用藥組均能使G0／G1期細胞比例降低，S期和G2／M期細胞比例升高，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而去肉桂組對細胞周期的影響與模型組相比無明顯差異。結(jié)論 十全大補湯對氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞具有調(diào)控成纖維細胞周期、促進增殖的作用，而適當增加肉桂劑量可以起到增效的作用。

氧化應(yīng)激； 創(chuàng)面修復(fù)； 纖維細胞細胞； 十全大補湯； 肉桂

成纖維細胞是創(chuàng)面主要的修復(fù)細胞，其生物學行為決定了創(chuàng)面修復(fù)的轉(zhuǎn)歸［1］。當前研究表明慢性創(chuàng)面存在著氧化應(yīng)激反應(yīng)的失衡，過度的氧化損傷延遲了創(chuàng)面的愈合［2-3］。本實驗在成功建立大鼠真皮成纖維細胞氧化應(yīng)激模型的基礎(chǔ)上，觀察十全大補湯調(diào)整肉桂劑量對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響，從抗氧化損傷角度探討中醫(yī)藥促進創(chuàng)面愈合的機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF／VAF級Wistar大鼠54只，雄性，體重280～300 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供。用隨機數(shù)字表法將大鼠分為6組，即正常對照組（無氧化損傷模型）、模型組、去肉桂組、原方組、2倍肉桂組和4倍肉桂組，每組8只大鼠。另6只大鼠用于原代培養(yǎng)真皮成纖維細胞。

1.2 中藥復(fù)方組成及配方顆粒的制備

十全大補湯的藥物原方組成為：當歸9 g、白術(shù)4.5 g、茯苓9 g、甘草3 g、熟地黃9 g、白芍4.5 g、人參3 g、川芎3 g、黃芪9 g、肉桂1.5 g（《醫(yī)學發(fā)明》）。去肉桂組藥物組成為：原方去肉桂；原方組藥物組成為：十全大補湯原方；2倍肉桂組藥物組成為：肉桂劑量為原方肉桂劑量的2倍；4倍肉桂組藥物組成為：肉桂劑量為原方肉桂劑量的4倍。由北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院中藥房按照藥物用量制成配方顆粒。配方顆粒于開始灌胃的前一周制備完成，常溫保存。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司；胎牛血清購自天津TBD公司；過氧化氫（30%）購自西隴化工股份有限公司；四甲基偶氮唑藍［3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide，MTT］購自Sigma；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）購自美國Amresco；碘化吡啶（propidium iodide，PI）購自Sigma；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）購自上海江萊生物科技有限公司。倒置光學顯微鏡：OLYMPUS 1X71型；SAFIREⅡ多功能全波長酶標儀：奧地利Digiscan SA 1000；流式細胞儀：美國BD公司（Becton，Dickinson and Company）產(chǎn)FAGSCalibur E1591型。

1.4 原代培養(yǎng)大鼠真皮成纖維細胞

健康大鼠6只，稱重后，用新配制的10%水合氯醛按0.4 m l／100 g腹腔注射麻醉大鼠。大鼠進入深麻醉狀態(tài)后，用硫化鋇脫毛劑將其背部皮膚脫毛，脫毛面積約為3 cm×5 cm。脫毛后，用75%酒精擦拭皮膚進行消毒，隨后將大鼠送入超凈工作臺內(nèi)。再次用75%酒精消毒皮膚，剪取2 cm×4 cm大小背部皮膚，取皮后大鼠斷頸處死。將剪下的皮膚用PBS反復(fù)沖洗，洗去血液，剪除皮下筋膜、結(jié)締組織。將皮片置于含有DMEM培養(yǎng)液的平皿中，剪成數(shù)條皮條。真皮面向上，將真皮組織剪成1 cm× 1 cm大小的組織塊（剪取后會團縮到大約0.5 cm2左右大小）。將剪好的組織塊種入提前用培養(yǎng)液濕潤過的瓶底25 cm2的培養(yǎng)瓶中，每瓶種入25塊。植塊后，瓶底向上，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中。3小時后從培養(yǎng)箱中取出培養(yǎng)瓶，翻轉(zhuǎn)瓶底向下，每瓶中加培養(yǎng)液1ml。隨后將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察，經(jīng)培養(yǎng)60小時可見部分組織塊周圍有少量成纖維細胞爬出。5天后貼壁細胞逐漸增多，多數(shù)組織塊周圍游離出成纖維細胞。更換培養(yǎng)液后，隨時間推移，組織塊周圍可見有大量成纖維細胞包繞。從形態(tài)上看，成纖維細胞呈梭形或不規(guī)則三角形，放射狀或漩渦狀走行。12天后組織塊移出的單層細胞匯合，細胞鋪滿瓶底，進行消化傳代［4］。

1.5 氧化應(yīng)激大鼠真皮成纖維細胞模型

取對數(shù)生長期細胞，用DMEM高糖完全培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整為1×105／ml。接種于96孔細胞培養(yǎng)板中，分為正常對照組（無氧化損傷模型），模型組、去肉桂組、原方組、2倍肉桂組和4倍肉桂組。每組每時段每濃度設(shè)置6個復(fù)孔［5］。每孔100μl細胞懸液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)液。正常對照組，每孔加入不含H2O2的無血清DEME培養(yǎng)液100μl，其余5組每孔加入濃度為500μmol／L的H2O2無血清DEME培養(yǎng)液100μl，置于培養(yǎng)箱中刺激30分鐘（H2O2濃度和刺激時間為前期實驗摸索，相關(guān)內(nèi)容將另文發(fā)表）。

1.6 復(fù)方含藥血清的制備

大鼠分組后，各組按人和大鼠間體表面積折算公式，計算每只大鼠每天的給藥劑量，每只每天灌胃1次，每次灌胃4 m l。正常對照組和模型組給予4 m l生理鹽水灌胃。連續(xù)給藥3天，第4天給藥后1小時，10%水合氯醛（0.4 m l／100 g）腹腔注射麻醉。麻醉成功后，將大鼠腹面向上固定于鼠板上，逐層打開皮膚、肌肉等各層組織，暴露腹主動脈后采血。采血后，將采血管室溫避光靜置1小時及4℃靜置1小時，待凝血堅固，血清析出，4℃，3000 r／min離心15分鐘，分離血清。吸出血清后，將同組大鼠血清混勻，分裝，－70℃冷藏備用。

1.7 不同濃度含藥血清對氧化損傷成纖維細胞增殖的影響

按照分組，各組氧化應(yīng)激大鼠真皮成纖維細胞模型，分別加入對應(yīng)的血清濃度為5%、10%、15%的DMEM培養(yǎng)液200μl。每組每時段每濃度設(shè)置6個復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時、48小時。分別于培養(yǎng)24小時、48小時后，各孔加入20μl MTT（5 mg／ml），并置于培養(yǎng)箱中孵育4小時后，在鏡下觀察是否已形成紫色結(jié)晶，盡量吸凈孔內(nèi)液體，各孔再加入DMSO 100μl，搖床避光振蕩10分鐘。用多功能全波長酶標儀在570 nm波長下，檢測各孔光密度值（optical density，OD）［6］。

1.8 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

取對數(shù)生長期細胞，用DMEM高糖完全培養(yǎng)液將細胞濃度調(diào)整為1×106／ml，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，每瓶1 ml細胞懸液，分組設(shè)置為正常對照組、模型組、去肉桂組、原方組、2倍肉桂組及4倍肉桂組，每組6瓶，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。待細胞貼壁，棄去培養(yǎng)液，正常對照組加入不含H2O2的無血清DEME培養(yǎng)液2 ml，其余5組加入500μmol／L的H2O2無血清培養(yǎng)液2 ml，置于培養(yǎng)箱中刺激30分鐘后用PBS漂洗兩次。各組加入對應(yīng)的10%含藥血清DMEM培養(yǎng)液3 ml／瓶，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時、48小時。分別于培養(yǎng)24小時、48小時后，胰酶消化、離心收集細胞，用預(yù)冷的PBS洗滌細胞兩次。最后一次留500μl PBS，混勻細胞，逐滴加入到5 ml 70%預(yù)冷乙醇中，邊加邊搖晃均勻，置冰上45分鐘后保存于4℃固定液過夜。檢測當天，取出固定保存的細胞，以1000 r／min離心5分鐘，棄去固定液，加入PBS，同樣條件下再離心洗滌一次，留300μl PBS，打散細胞團，加入10 mg／ml的RNase A 5μl，37℃條件下放置1小時，然后加入10 mg／ml的PI染液5μl，室溫下避光反應(yīng)30分鐘，上機前用200目尼龍網(wǎng)過濾，用流式細胞儀測定細胞周期。計算細胞增殖指數(shù)（proliferation index，PI）（%）＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）×100%［7］。

1.9 統(tǒng)計學分析

全部數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果以均數(shù)±標準差表示，采用方差分析比較組間差異，以雙側(cè)P＜0.05為有統(tǒng)計學意義，以雙側(cè)P＜0.01為有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度含藥血清對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響

使用500μmol／L的H2O2刺激細胞30分鐘后，在同一時間點相同血清濃度的條件下，與正常對照組相比各組細胞OD值明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。藥物干預(yù)24小時后，5%濃度組中各用藥組與模型組相比OD值無明顯差異；10%濃度組中2倍肉桂組和4倍肉桂組OD值升高，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；15%濃度組中2倍肉桂組OD值明顯升高，與模型組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。藥物干預(yù)48小時后，5%濃度組中2倍肉桂組和4倍肉桂組OD值明顯升高，與模型組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；10%濃度組中2倍肉桂組OD值明顯升高，與模型組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；15%濃度組中各用藥組OD值與模型組相比無明顯差異。在四個用藥組中，2倍肉桂組在兩個時間點上的OD值均為最高。見表1。

2.2 四組藥物對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞細胞周期的影響

使用500μmol／L的H2O2刺激細胞30分鐘后，G0／G1期細胞比例增高，S期和G2／M期細胞比例降低，與正常對照組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。藥物干預(yù)24小時后，各用藥組G0／G1期細胞比例降低，S期和G2／M期細胞比例增高，與模型組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），見表2。藥物干預(yù)48小時后，原方組和4倍肉桂組G0／G1期細胞比例降低，S期和G2／M期細胞比例增高，與模型組相比差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），2倍肉桂組G0／G1期細胞比例明顯降低，S期和G2／M期細胞比例明顯增高，與模型組相比差異具有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），而去肉桂組對細胞周期的影響與模型組相比無明顯差異。在四個用藥組中，2倍肉桂組在兩個時間點上的細胞增殖率均為最高，見表3。

表1 不同濃度四組藥物對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響（±s，n＝6）

表1 不同濃度四組藥物對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞增殖的影響（±s，n＝6）

注：與同一時間點正常對照組比較aP＜0.01，bP＜0.05；與同一時間點模型組比較cP＜0.01，dP＜0.05

組別 血清濃度 24小時OD值 48小時OD值5% 0.8393±0.2733 0.9160±0.0810 10% 1.0380±0.1958 1.1792±0.1473 15% 0.7383±0.2821 1.3567±0.3280模型組 5% 0.3500±0.0850a0.3579±0.1076a10% 0.4316±0.0579a0.5437±0.0941a15% 0.2847±0.1106b0.3302±0.1636a去肉桂組 5% 0.3056±0.1262a0.4039±0.0859a10% 0.5180±0.1152a0.6401±0.1569a15% 0.2401±0.0762a0.3484±0.0286a原方組 5% 0.2922±0.0707a0.4053±0.0999a10% 0.4603±0.1045a0.6601±0.1422a15% 0.2408±0.1217a0.1907±0.0426a2倍肉桂組 5% 0.4389±0.1371b0.5168±0.1006ac10% 0.5896±0.1111ad0.7596±0.1839ac15% 0.5342±0.1330c0.4951±0.2066a4倍肉桂組 5% 0.3132±0.0780a0.4930±0.0707ac10% 0.5588±0.0901ad0.6517±0.1112a15% 0.3292±0.0761a0.3215±0.0748正常對照組a

表2 四組藥物對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞周期的影響（24小時）±s，n＝3）

表2 四組藥物對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞周期的影響（24小時）±s，n＝3）

注：與同一時間點正常對照組比較aP＜0.01；與同一時間點模型組比較bP＜0.01

組別 G0／G1（%） S（%） G2／M（%）PI（%）70.99±0.46 22.30±0.85 6.71±0.79 29.01模型組 88.30±0.43a9.44±0.27a2.26±0.27a11.70去肉桂組 80.39±0.34ab16.22±0.37ab3.39±0.53ab19.61原方組 75.99±0.73ab14.87±0.89ab9.14±0.33ab24.01 2倍肉桂組74.82±0.50ab16.64±0.50ab8.55±0.17ab25.18 4倍肉桂組77.88±0.14ab13.78±0.16ab8.34±0.16ab正常對照組22.12

表3 四組藥物對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞周期的影響（48小時）（±s，n＝3）

表3 四組藥物對氧化損傷大鼠真皮成纖維細胞周期的影響（48小時）（±s，n＝3）

注：與同一時間點正常對照組比較aP＜0.01；與同一時間點模型組比較bP＜0.01，cP＜0.05

組別 G0／G1（%） S（%） G2／M（%）PI（%）71.20±0.59 15.29±0.76 13.51±0.45 28.80模型組 95.56±0.20a3.87±0.13a0.56±0.08a4.44去肉桂組 94.69±0.25a4.18±0.32a1.13±0.24a5.31原方組 94.25±0.19ac4.58±0.17ac1.17±0.06ac5.75 2倍肉桂組89.55±0.40ab8.62±0.28ab1.83±0.13ab10.45 4倍肉桂組91.82±0.04ac7.07±0.06ac1.11±0.08ac正常對照組8.18

3 討論

成纖維細胞具有合成、分泌膠原蛋白、糖胺多糖等細胞外基質(zhì)成分的作用。在組織形成、保持組織形態(tài)以及組織損傷的修復(fù)等過程均發(fā)揮重要作用。它與預(yù)先制備的細胞外基質(zhì)網(wǎng)架材料共同形成了真皮結(jié)構(gòu)［8］。因此，研究成纖維細胞在體外培養(yǎng)條件下增殖、分化的調(diào)控因素，具有重要意義。

在本實驗中，MTT結(jié)果顯示500μmol／L的H2O2刺激大鼠真皮成纖維細胞30分鐘，可明顯抑制細胞的增殖，說明活性氧H2O2可以對大鼠真皮成纖維細胞的增殖起到抑制作用。5%濃度組中的2倍肉桂組、4倍肉桂組在藥物作用48小時后對細胞增殖具有明顯促進作用；10%濃度組中4倍肉桂組在藥物作用24小時后對細胞增殖具有促進作用，2倍肉桂組在藥物作用24小時及48小時后均能夠促進細胞增殖；15%濃度組中2倍肉桂組在藥物作用24小時后對細胞增殖具有明顯促進作用。其余各組對細胞增殖的影響不明顯。綜合以上結(jié)果可以看出，2倍肉桂組和4倍肉桂組在一定程度上對氧化損傷的大鼠真皮成纖維細胞具有促進增殖的作用，而去肉桂組及原方組對細胞增殖的影響較小。

流式細胞術(shù)檢測結(jié)果表明在藥物干預(yù)24小時后，四個用藥組G0／G1期細胞比例降低，而S期和G2／M期細胞比例升高，在藥物干預(yù)48小時后，除了去肉桂組以外，其余三個用藥組均能使G0／G1期細胞比例降低，S期和G2／M期細胞比例升高。表明四個用藥組均能夠解除細胞阻滯，增加S期細胞比例，促進細胞不斷分裂增殖。其中以原方組、2倍肉桂組及4倍肉桂組作用顯著。

中醫(yī)學認為難愈性創(chuàng)面屬于“陰證潰瘍”的范疇，其主要的治療原則是“煨膿長肉法”，在臨床現(xiàn)象上表現(xiàn)為創(chuàng)面出現(xiàn)黏稠明凈的“膿”是創(chuàng)面轉(zhuǎn)陽向愈的一個重要標志；從治法而言，“補法”是治療潰瘍的主要治法，但“潰瘍”中的“陰證潰瘍”則需要在補益法的基礎(chǔ)上配伍適量的溫通藥物促進創(chuàng)面由陰證向陽證的轉(zhuǎn)化。如陳實功在《外科正宗》中所論述“腐肉雖脫，新肉生遲，如凍色者，肉冷肌寒，大溫氣血”。又如《外科全生集》所論述：“若滋補不兼溫暖，則孰為釀膿之具，然膿之來必由氣血?！庇杀緦嶒灴梢钥闯鲅a益法與溫補法均有促進氧化損傷成纖維細胞增殖的作用，從而根據(jù)整體和局部辨證的結(jié)果適當調(diào)整溫通藥物的配伍則起著“畫龍點睛”的作用，符合中醫(yī)學“煨膿長肉”的促愈理論。

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Influence of Shiquan Dabu Decoction and different doses of cinnamon com patibility on oxidativedamaged rat dermal fibroblasts proliferation

HAO Jue，TANG Ying，WANG Shun-mei，et al.School of Preclinical Medicine Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China Corresponding author：DAIHong-yu，E-mail：dhy515＠163.com

Objective To investigate themechanism of Shiquan Dabu Decoction（literally，Com-plete Ten-medicinals Nourishment Decoction）with varying doses of cinnamon composed in its benefits to wound／skin repair from the perspective of cell division and cell cycle.M ethods Rat dermal fibroblasts was obtained by in-vitro culture.The serums extracted with serum pharmacological approacheswere used to interfere the oxidative-damaged rat dermal fibroblasts.Next，Methyl thiazol tetrazolium（MTT）-assay was used tomeasure the effects of the serums on cell proliferation；and flow cytometry were employed to test the effects on cell cycle.Results OD value decreased significantly in MTT-assaywhen 500μmol／LH2O2had stimulated rat dermal fibroblasts for30minutes.And the proportion ofG0／G1 period increased significantly while the proportion of Sand G2／M period decreased significantly.The rate of apoptosis increased significantly.Mitochondrialmembrane potential decreased significantly.And the level of reactive oxygen species increased significantly.After 24 hours of serums treatment，the OD values of the double cinnamon group and the four times cinnamon group increased in the group of 10%serum concentration.The OD value of the double cinnamon group increased significantly in the group of15%serum concentration.After48 hours of serums treatment，the OD values of the double cinnamon group and the four times cinnamon group increased significantly in the group of5%serum concentration.The OD value of the double cinnamon group increased significantly in the group of 10%serum concentration.The OD values of the double cinnamon group in two time pointswere both the highest in the four groups.After 24 hours of serums treatment，the proportion of G0／G1 period ofall four groups decreased significantly，and the proportion of Sand G2／M period of all four groups increased significantly.After 48 hours of serums treatment，the proportion of G0／G1 period of the Shiquan Dabu Decoction group，the double cinnamon group and the four times cinnamon group decreased，and the proportion of S and G2／M period of the three groups increased.The proliferation index of the double cinnamon group in two timepoints were both the highest in the four groups.Conculusion Shiquan Dabu Decoction can acceleratewound healing into skin restoration through promoting cell proliferation controlling the proliferation of filbrohlasts from granulation tissue of the wound.And the function can be enhanced if the dose of cinnamon is increased on the basis of Shiquan Dabu Decoction.

Oxidative stress； Wound healing； Dermal fibroblasts； Shiquan Dabu Decoction；Cinnamon

R285.5

A

10.3969／j.issn.1674-1749.2013.09.002

2013-05-30）

（本文編輯：黃凡）

北京市自然科學基金（7112072）；北京中醫(yī)藥大學自主選題資助項目（20111003）

100029北京中醫(yī)藥大學基礎(chǔ)醫(yī)學院［郝鈺、唐瑩（碩士研究生）、王順梅（碩士研究生）］；北京中醫(yī)藥大學東方醫(yī)院肛腸科［代紅雨、杜冠潮（碩士研究生）］

郝鈺（1964－），女，博士，教授。研究方向：中藥的免疫調(diào)節(jié)機制研究。E-mail：huangshiren64＠qq.com

代紅雨（1971－），博士，副主任醫(yī)師。研究方向：中醫(yī)藥促進難愈性創(chuàng)面愈合的研究。E-mail：dhy515＠163.com