中國(guó)明對(duì)蝦卵黃蛋白原基因啟動(dòng)子克隆與分析

謝松，李理想，陳宏健，孫玲玲，柳峰松

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北省無脊椎動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002）

中國(guó)明對(duì)蝦卵黃蛋白原基因啟動(dòng)子克隆與分析

謝松，李理想，陳宏健，孫玲玲，柳峰松

（河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北省無脊椎動(dòng)物系統(tǒng)學(xué)與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室，河北保定 071002）

為了探明中國(guó)明對(duì)蝦卵黃蛋白原基因啟動(dòng)子表達(dá)調(diào)控機(jī)制，利用DNA步移法克隆了中國(guó)明對(duì)蝦卵黃蛋白原基因啟動(dòng)子及其上游調(diào)控序列，總長(zhǎng)1 100bp.分析表明，在基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游－30～－24bp處有1個(gè)TATA box，未發(fā)現(xiàn)有CAAT box和GC box.同時(shí)，在上游調(diào)控區(qū)還存在有多個(gè)可能影響啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的順式作用元件，如NF－κB，YY1和SP1等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn).這些結(jié)果為深入研究中國(guó)明對(duì)蝦卵黃蛋白積累及卵子發(fā)生過程奠定了基礎(chǔ).

卵黃蛋白原；DNA步移；啟動(dòng)子；順式作用元件

卵黃是甲殼動(dòng)物胚胎發(fā)生及早期幼體發(fā)育的主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).胚胎和開口前幼體發(fā)育、生長(zhǎng)所需的能量和營(yíng)養(yǎng)完全依賴卵黃.因此，卵黃含量和質(zhì)量對(duì)于早期幼體維持生命是至關(guān)重要的.卵黃蛋白（vitellin，Vn）是一種高密度糖脂磷蛋白，是卵黃的主要成分.而卵黃蛋白原（vitellogenin，Vg）是Vn的前體，在肝胰腺或卵巢中合成，被卵母細(xì)胞攝取加工而成Vn.

雌性動(dòng)物卵黃生成期可大量合成Vg，而在其他生活時(shí)期和雄性動(dòng)物體內(nèi)的Vg含量卻很低.但后來人們又發(fā)現(xiàn)，雄性動(dòng)物和幼年動(dòng)物在人工雌激素或低劑量的類雌激素長(zhǎng)期作用下，都能誘導(dǎo)體內(nèi)Vg的生成［1－2］.因此，通過檢測(cè)雄性卵生動(dòng)物體內(nèi)Vg合成可以評(píng)價(jià)環(huán)境中的內(nèi)分泌干擾化合物（endocrine－disrupting chemicals，EDCs），也可用于環(huán)境內(nèi)分泌干擾物的篩選及環(huán)境毒理、污染調(diào)查等研究之中.例如，經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織（OECD）已經(jīng)將Vg作為環(huán)境雌激素化學(xué)物理想的暴露標(biāo)志物［3］.幾種環(huán)境EDC檢測(cè)生物的Vg基因結(jié)構(gòu)已經(jīng)被研究［1］.此外，Lee等（2008）克隆了日本虎斑猛水蚤（Tigriopus japonicus）Vg啟動(dòng)子，發(fā)現(xiàn)其啟動(dòng)子區(qū)不但含有雌性激素應(yīng)答元件，還含有1個(gè)金屬應(yīng)答元件，可以受到重金屬鎘的誘導(dǎo)調(diào)控.

目前已從多種甲殼動(dòng)物體內(nèi)分離到Vn，并進(jìn)行了生化性質(zhì)研究.與其他甲殼動(dòng)物Vn類似，中國(guó)明對(duì)蝦（Fenneropenaeus chinensis）Vn也是一種糖脂磷蛋白.本課題組已經(jīng)對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦卵Vg基因的cDNA進(jìn)行了克隆，實(shí)驗(yàn)證實(shí)此基因在卵黃發(fā)生過程中的雌性對(duì)蝦肝胰腺和卵巢中特異性表達(dá)［4］，但其表達(dá)的調(diào)控的分子機(jī)制尚不清楚.

在產(chǎn)卵季節(jié)，中國(guó)明對(duì)蝦能在短短幾天之內(nèi)積累大量卵黃，說明Vg基因上具有1個(gè)非常強(qiáng)的啟動(dòng)子，加上Vg基因表達(dá)關(guān)系到生殖發(fā)育等重要調(diào)控過程，所以Vg啟動(dòng)子及其信號(hào)途徑的研究具有重要價(jià)值.本實(shí)驗(yàn)通過DNA步移的方法克隆Vg基因5′端上游序列，并通過生物信息學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行分析，從而為探明Vg基因調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

購自于市場(chǎng)上的健康中國(guó)明對(duì)蝦.

1.1.2 生化試劑

DNA提取試劑盒為北京天根生化公司產(chǎn)品；Tag DNA聚合酶、平末端限制性內(nèi)切酶（EcoRⅤ，DraⅠ，AfaⅠ，PvuⅡ），pMD18－T載體等購自TaKaRa公司，DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒為北京康為生物科技公司產(chǎn)品，測(cè)序工作由南京金斯瑞生物技術(shù)公司完成.

1.2 方法

1.2.1 中國(guó)明對(duì)蝦基因組文庫的構(gòu)建

利用DNA提取試劑盒提取明對(duì)蝦DNA，用質(zhì)量濃度10g／L的瓊脂糖電泳檢測(cè)DNA的質(zhì)量.分別用AfaⅠ，DraⅠ，EcoRⅤ和PvuⅡ4種平末端的限制性內(nèi)切酶消化，然后將消化產(chǎn)物分別與DNA接頭（Genome Walker Adaptor，如圖1）連接，即為中國(guó)明對(duì)蝦Genome Walker文庫.

圖1 接頭與接頭引物Fig.1 Structure of the Genome Walker adaptor and adaptor primers

1.2.2 Vg基因5′上游區(qū)的克隆

根據(jù)中國(guó)明對(duì)蝦Vg基因cDNA序列（GenBank：DQ354690.1）設(shè)計(jì)基因特異性反向引物R1和R2，同時(shí)根據(jù)接頭序列設(shè)計(jì)接頭引物AP1和AP2.以Genome Walker文庫為模板，AP1和R2為引物進(jìn)行第1輪PCR，反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，55℃退火40s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10min.然后，將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋30倍作為模板，用引物AP2和R1進(jìn)行第2輪PCR.第2輪PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，57℃退火40s，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10min.最后，把回收片段連接pMD18－T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)PCR篩選陽性克隆后測(cè)序.

根據(jù)測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)特異引物R3和R4.以DNA文庫為模板，以AP1和R3，AP2和R4為引物，進(jìn)行2輪PCR，然后檢測(cè)，PCR產(chǎn)物回收，測(cè)序.

將這2次測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，同時(shí)設(shè)計(jì)引物R5.以DNA文庫為模板，以AP1和R4，AP2和R5為引物進(jìn)行PCR.DNA回收，測(cè)序.

將這3次測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，同時(shí)設(shè)計(jì)引物F1和R6，以中國(guó)明對(duì)蝦DNA為模板進(jìn)行克隆驗(yàn)證，克隆產(chǎn)物回收，測(cè)序.實(shí)驗(yàn)中所用引物見表1.

表1 PCR引物Tab.1 Primers for PCR

1.2.3 Vg基因啟動(dòng)子及上游調(diào)控元件分析

對(duì)獲得的中國(guó)明對(duì)蝦Vg基因上游序列進(jìn)行分析.利用網(wǎng)站http：／／www.fruitfly.org／seq＿tools／promoter.html上的NNPP程序和http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml？topic＝tssg＆group＝programs＆subgroup＝promoter的TSSG程序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)以及核心啟動(dòng)子位置預(yù)測(cè).同時(shí)，綜合利用網(wǎng)站http：／／linux1.softberry.com／berry.phtml？topic＝nsite＆group＝programs＆subgroup＝promoter的在線程序Softberry和http：／／www.gene－regulation.com／cgi－bin／pub／programs／match／bin／files.cgi網(wǎng)站中的AliBaba 2.1，Match以及http：／／www.dna.affrc.go.jp／PLACE／signalup.html的SignalScan程序進(jìn)行上游順式調(diào)控元件序列分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 基因上游區(qū)序列克隆

根據(jù)中國(guó)明對(duì)蝦Vg基因cDNA序列設(shè)計(jì)反向引物，以Genome Walker文庫為模板，利用反向引物和接頭引物進(jìn)行擴(kuò)增，先后得到1個(gè)1 000bp和2個(gè)250bp的片段.將3次測(cè)序得到的序列拼接，并設(shè)計(jì)引物利用PCR驗(yàn)證，最終得到1條1 185bp的Vg基因上游序列.

2.2 啟動(dòng)子及調(diào)控序列分析

經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，同大多數(shù)真核生物一樣，在預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（＋1位）上游－30～－24bp的區(qū)域存在著1個(gè)典型的TATA box，但未發(fā)現(xiàn)GC box和CAAT box（圖2）.綜合多個(gè)網(wǎng)站的預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行篩選可以看出，中國(guó)明對(duì)蝦Vg基因上游調(diào)控區(qū)含有多種潛在的順式作用元件，如SP1，YY1，NF－GMb，GHF1／Pit1，NF1，CDP以及NF－κB等轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件（圖2）.

圖2 1.1kb的中國(guó)明對(duì)蝦卵黃蛋白基因組基因5′上游序列Fig.2 5′upstream fragment of the vitellogenin gene of Fenneropenaeus chinensis and containing the putative cis－regulatory elements in boxes

3 討論

迄今為止，有關(guān)甲殼動(dòng)物Vn的研究多集中在卵黃蛋白原的合成部位，在外源刺激作用下卵黃蛋白原的合成途徑，卵黃蛋白原的結(jié)構(gòu)特性，卵黃蛋白原的生物學(xué)功能以及卵黃蛋白原作為檢測(cè)環(huán)境激素的生物標(biāo)志物的應(yīng)用等幾個(gè)方面［5］.鑒于有關(guān)Vg基因表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究較為薄弱，本文對(duì)中國(guó)明對(duì)蝦卵Vg基因上游序列進(jìn)行了克隆，并對(duì)啟動(dòng)子及順式作用元件進(jìn)行了一系列的生物信息學(xué)分析.

真核生物基因核心啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)一般包含有TATA box，有的基因甚至有多個(gè)TATA box.而本課題組發(fā)現(xiàn)中國(guó)明對(duì)蝦Vg基因上游序列只有1個(gè)TATA box，其存在于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游－30～－24bp處，沒有找到典型的CAAT box和GC box，這種缺失可由轉(zhuǎn)錄因子來彌補(bǔ).在所預(yù)測(cè)的核心啟動(dòng)子上游，利用各種程序找到了多種潛在的順式作用元件，經(jīng)過篩選本課題組保留了SP1，YY1，NF－GMb，GHF1／Pit1，CDP以及NF－κB等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合元件作為重點(diǎn)進(jìn)行討論.

核因子SP1（Specificity Protein 1），屬于Sp／KLF家族成員，含有1個(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域，能直接結(jié)合DNA，對(duì)多種基因（如核酸代謝相關(guān)基因、氧化磷酸化相關(guān)基因等）均有調(diào)控作用［6］.它既可以正性調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，也可以對(duì)某些基因進(jìn)行負(fù)性調(diào)控（包括P21、β類球蛋白基因等）［7－8］.此外，它還參與了細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化、調(diào)控細(xì)胞周期調(diào)控分子、生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及細(xì)胞凋亡等過程［9］.

轉(zhuǎn)錄因子YY1（yin－yang 1）也是一種至關(guān)重要的調(diào)控因子，它屬于GLI－Kruppel家族的鋅指蛋白，其作用元件廣泛存在于多個(gè)基因中，具有抑制和激活轉(zhuǎn)錄的雙重功能.例如，人們發(fā)現(xiàn)c－fos，loricrin，HDL－R等基因受到Y(jié)Y1的抑制作用，在c－Myc、核糖體蛋白L30基因中YYI起激活作用［10－11］.而Shi等（1991）曾發(fā)現(xiàn)，腺病毒E1A蛋白能將YY1從轉(zhuǎn)錄阻抑因子轉(zhuǎn)變成轉(zhuǎn)錄激活因子.此外，YY1也可以和其他因子共同發(fā)揮作用，1996年，Adrian等研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子SP1和YY1共同參與調(diào)控了人類轉(zhuǎn)鐵蛋白基因，轉(zhuǎn)錄因子SP1表現(xiàn)出促進(jìn)作用，而YY1則顯現(xiàn)出抑制作用.

轉(zhuǎn)錄因子NF－GMb是冷休克蛋白結(jié)構(gòu)域（cold－shock domain，CSD）蛋白家族成員，一般結(jié)合在上游序列靠近啟動(dòng)子的地方.它能抑制一些基因轉(zhuǎn)錄如白細(xì)胞介素－1β（IL－1β），IL－2，IL－3，IL－8，腫瘤壞死因子－α（TNF－α），IL－2受體－α，干擾素－β（IFN－β），LD78，VCAM－1和ELAM－1等［12－13］，但是在一些外源物質(zhì)（如聚丙烯酸甲酯）的刺激下能加強(qiáng)基因的轉(zhuǎn)錄水平.此外，轉(zhuǎn)錄因子NF－GMb還參與了調(diào)控組織再生、繁殖、胚胎發(fā)育、精子形成以及細(xì)胞凋亡等生理過程.

轉(zhuǎn)錄因子GHF1／Pit1也叫POU1F1（Pituitary－specific positive transcription factor 1），是一種生長(zhǎng)激素基因激活因子，它在調(diào)控哺乳動(dòng)物催乳激素及促甲狀腺激素等基因中起到重要的作用［14］.

CDP（CCAAT displacement protein）家族包含多個(gè)高度保守的同源蛋白，它們參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化和發(fā)育.作為一種反式作用因子，CDP往往結(jié)合在DNA上游區(qū)來抑制基因轉(zhuǎn)錄，也可以通過抑制其他轉(zhuǎn)錄因子（如NF－κB，AP－2等）的方式來抑制轉(zhuǎn)錄［15－16］.

核因子NF－κB是一種重要的調(diào)控因子，是由2個(gè)Rel蛋白單體組成的二聚物轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控一系列參與細(xì)胞生理活動(dòng)的基因，參與先天性和獲得性免疫應(yīng)答、細(xì)胞調(diào)亡、炎癥、應(yīng)激和淋巴形成等生理活動(dòng)［17－19］.

近來，人們經(jīng)過多方面的研究發(fā)現(xiàn)Vg在生物體先天免疫中擔(dān)負(fù)著重要的作用，它作為一個(gè)多元的分子識(shí)別受體，能識(shí)別脂多糖、葡聚糖、肽聚糖、磷壁酸以及病毒等，具有殺菌、抗氧化等功能［20－21］.此外，它在免疫應(yīng)答等方面也有重要的作用.通過本課題組的實(shí)驗(yàn)可以看出在Vg基因上游存在多個(gè)與免疫相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，這也有助于對(duì)Vn功能的研究.

本實(shí)驗(yàn)克隆得到了中國(guó)明對(duì)蝦Vg基因上游調(diào)控序列，預(yù)測(cè)了一些可能與啟動(dòng)子活性或者啟動(dòng)子應(yīng)答外源刺激有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，同時(shí)對(duì)這些轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行了一些分析.但是，這些轉(zhuǎn)錄因子是否在Vg基因中發(fā)揮作用仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證.

甲殼動(dòng)物能在短短幾天之內(nèi)積累大量卵黃，說明Vg基因上有1個(gè)非常強(qiáng)的啟動(dòng)子.本課題組的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在Vg基因上游序列有多個(gè)可能增強(qiáng)啟動(dòng)子功能的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)如NF－κB，YY1，SP1等，因此筆者推測(cè)在這些因子的共同作用下Vg基因啟動(dòng)子活性大大增強(qiáng)，從而調(diào)控基因短時(shí)間內(nèi)大量合成Vn.在下一步的實(shí)驗(yàn)中，會(huì)根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)種種預(yù)測(cè)進(jìn)行具體的驗(yàn)證，來完善Vg基因啟動(dòng)子調(diào)控模式，以便為其以后的應(yīng)用提供理論支持.

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（責(zé)任編輯：趙藏賞）

Cloning and analysis of the promoter of Fenneropenaeus chinensis vitellogenin gene

XlE Song，Ll Lixiang，CHEN Hongjian，SUN Lingling，LlU Fengsong
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Laboratory of Invertebrate Systematics and Application of Hebei Province，Baoding 071002，China）

In order to investigate the mechanism of the expression and regulation of the Fenneropenaeus chinensis vitellogenin gene，the promoter and the up－stream regulatory fragment of 1 100bp were amplified by Genome Walker method.Analysis showed that the“TATA box”was located at－30－24bp in the front of the transcription initiation site，but the“CAAT box”and“GC box”were absent.Meanwhile，among the upstream regulatory region，there were a few cis－acting elements which might affect the activity of promoter，such as NF－κB，YY1，SP1，and so on.These results laid the foundation for us to study the accumulation of the vitellin and the oogenesis of Fenneropenaeus chinensis in depth.

vitellogenin；Genome Walker；promoter；cis－actingelement

Q81

A

1000－1565（2013）02－0175－06

10.3969／j.issn.1000－1565.2013.02.012

2012－12－15

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（C2010000256，C2011201027）；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助項(xiàng)目（20101301120005）；河北大學(xué)自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2011218）

謝松（1964－），男，江西尋烏人，河北大學(xué)教授，主要從事甲殼類營(yíng)養(yǎng)與發(fā)育研究.

柳峰松（1976－），男，河北任丘人，河北大學(xué)教授，從事無脊椎動(dòng)物分子免疫學(xué)研究.E－mail：liufengsong＠hbu.edu.cn